利用场效应生物传感技术探究分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用

FEB 是一种无标记、低成本的______ _______相互作用检测平台，可提供快速且准确的测量。该方法可用于验证已知或未知的相互作用，并为生物分子相互作用的潜在抑制剂提供简便的检测手段。FEB 的主要优势在于其自动化且用户友好的软件，可在整个实验过程中引导用户操作，并配备开放的手动移液平台，使用户几乎无需培训即可开展工作。

FEB 技术在制药、小分子、肽和蛋白质的生物分子分析，以及通过将体外生物活性快速转化为体内功效来进行药物验证等多个领域也具有应用前景。作为初学者，在选择合适的分析物浓度以优化实验并获得可靠的 KD 值时，您可能会面临挑战。我们建议您重点关注芯片功能化过程以及正确的缓冲液置换。

首先通过反复吹吸等体积的EDC和sulfo-NHS溶液进行混合。将公司提供的生物传感器芯片放入带有配套盖子的玻璃培养皿中。建议芯片活化过程中的所有功能化步骤均在培养皿内进行。

向生物传感器芯片上加入50微升1摩尔的MES缓冲液。室温孵育1分钟。然后吸去缓冲液，并立即向传感器芯片上加入50微升EDC sulfo-NHS溶液。

盖上培养皿，在室温下孵育15分钟。用移液器吸去芯片上的EDC sulfo-NHS溶液，加入50微升1摩尔的MES缓冲液。吸去MES缓冲液，再用50微升1×PBS溶液冲洗芯片两次。

从芯片中吸除 PBS，并加入目标分子 Hsp90。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育 30 分钟。然后吸除含有目标分子的溶液，用 50 微升 1× PBS 洗涤三次。

从芯片中吸除1X PBS溶液，加入50 µL淬灭溶液一。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸除淬灭溶液一，加入50 µL淬灭溶液二。

盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。随后，从芯片中抽吸去除淬灭液二，并用50 µL的1×PBS缓冲液冲洗芯片5次，最后一次冲洗后在传感器上保留PBS液滴。配制Cdc37在所需浓度范围内的分析物稀释系列。

设计实验时应包含至少八种不同浓度的分析物，以获得可靠的解离常数（KD值），并在用于校准和目标蛋白的相同缓冲液中配制这些不同稀释度的溶液。将芯片小心地放入仪器中。确保软件已开启且LED指示灯变为绿色。

接下来，在自动化软件中点击“运行实验”模块，并选择包含再生步骤的10个点或其他任意所需方案。填写详细信息，例如操作员姓名、实验名称、日期、再生缓冲液、固定化靶标以及溶液中的分析物。按下软件上显示的“开始实验”按钮，并按照自动化软件显示的说明进行操作。

为进行仪器校准，从芯片中吸取剩余的 PBS 溶液，并加入 50 微升校准缓冲液。按下“继续”按钮，等待五分钟，直至校准步骤完成。软件将显示校准步骤确定的终点，并发出警告提示需进行后续操作。

接下来，通过从芯片中吸取校准缓冲液并加入50微升最低浓度的分析物来进行分析物结合。按下继续按钮，等待五分钟，直至结合步骤完成。软件将以警告提示音显示结合步骤的终点，提示继续操作。

为进行分析物解离，从芯片中吸出分析物溶液，并加入50微升解离缓冲液。按下继续按钮。解离步骤持续一段时间后，软件将显示解离步骤的终点，并发出警告警报。

接下来，通过从芯片中抽吸解离溶液并加入 50 µL 再生缓冲液来执行芯片再生。然后，按下继续按钮。再生步骤通常需要约 30 秒完成。

随后，软件会显示再生步骤的终点，并发出警告提示以供跟进。最后，为清洗芯片，需从芯片中吸出再生溶液，并加入 50 µL 洗涤缓冲液。从芯片中吸出溶液，重复此步骤五次。

在芯片上保留最后一滴洗涤缓冲液。然后，按下“继续”按钮，等待30秒，直至软件界面显示洗涤步骤完成。对所使用的每种分析物浓度重复上述步骤。

校准、分析物结合、解离、再生以及清洗五次的五个步骤构成一个循环。实验结束时，在自动分析软件中按下分析按钮。包含所有实验数据点的显示窗口将出现。

确保用于规定实验方案的分析物浓度准确无误。按下“运行分析”按钮以自动生成KD值。软件通过将分析物浓度与其对应的I响应值作图，生成Hill拟合曲线，并据此计算平衡状态下的解离常数。

目标蛋白Hsp90被固定在芯片上，首次实验中配制了10个浓度梯度的分析物蛋白Cdc37，浓度范围从25纳摩尔到5,000纳摩尔。此处展示了第一次实验生成的数据文件。此处显示了实时监测的实验数据。

Y轴对应生物传感器单位中的I响应，X轴对应实验中分析物的不同时间点和浓度。此处显示的图形表示由自动化分析软件生成的hill拟合曲线图。Y轴对应生物传感器单位中的I响应，X轴对应实验中分析物的不同浓度。

此处显示的图形表示使用统计分析软件生成的结合相图。Y轴对应结合相结束时的I响应值，X轴对应分析物Cdc37的不同浓度。在实验二中，使用了另一组浓度，范围从0.4 纳摩尔到200 纳摩尔，生成的数据文件如图所示。

图示为Hsp90与Cdc37相互作用的等温滴定量热法（ITC）热谱图。此处显示的是在298.15开尔文温度下，将Cdc37连续注入Hsp90中所得到的相应放热曲线。所用的差分功率是时间的函数。

该图中的集成数据点表示对应于 Hsp90 与 Cdc37 的穆勒比值的归一化热量。此处使用的开放式移液方法要求操作者熟练掌握手动移液技术，并确保移液枪头不接触生物传感器。步骤时间的可重复性完全取决于操作者。

一旦研究人员表征了两种生物分子之间的相互作用，便可利用FEB系统设计靶向该特定生物分子相互作用的潜在抑制剂或调节剂，进而开展筛选实验。该方法可用于鉴定、验证和定量已知及新发现的蛋白质之间，以及蛋白质与小分子（包括药物和多肽）之间的相互作用。