基于石墨烯生物传感器的场效应生物传感技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在调控大多数生物过程中至关重要。

使用场效应生物传感技术检测蛋白质相互作用（PPIs）时，首先采用石墨烯场效应晶体管芯片。该芯片包含一个羧基功能化的石墨烯表面，作为源极和漏极电极之间半导体通道。

将芯片与两性离子缓冲液中的新鲜碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐（sulfo-NHS）溶液共同孵育。该缓冲液可提供适宜的pH环境，促使碳二亚胺和sulfo-NHS活化芯片上功能化的羧基，形成可与胺基反应的酯。

加入目标蛋白溶液。伯胺与胺反应性酯发生反应，通过形成酰胺键将蛋白固定在芯片上。加入含胺的封闭溶液以阻断未结合的胺反应性酯，防止非特异性结合。

将芯片插入电子读取仪中，并用缓冲液进行校准。读取仪在电极之间施加恒定电压。在分析物未结合的条件下，测量电极间产生的电流。

加入最低浓度的分析物。分析物蛋白与芯片上固定的靶标之间的相互作用会改变石墨烯表面的局部电荷分布，该变化被记录为电流响应（I-response）——即电极间电流流动的变化。

记录完成后，用缓冲液洗涤以解离结合的分析物。随后，依次使用浓度递增的分析物重复分析。

I-反应信号随分析物浓度增加而逐渐增强，表明目标分子与分析物之间存在强蛋白-蛋白相互作用（PPIs）。

首先通过反复吹打混合等体积的EDC和sulfo-NHS溶液。将公司提供的生物传感器芯片置于带盖的玻璃培养皿中。建议芯片活化过程中的所有功能化步骤均在培养皿内进行。向生物传感器芯片上加入50微升1摩尔的MES缓冲液。在室温下孵育1分钟。

然后，吸去缓冲液，并立即向传感器芯片上加入 50 微升 EDC/sulfo-NHS 溶液。盖上培养皿，在室温下孵育 15 分钟。从芯片上吸去 EDC/sulfo-NHS 溶液，加入 50 微升 1 摩尔 MES 缓冲液。

吸去MES缓冲液，用50微升1×PBS将芯片冲洗两次。从芯片中吸去PBS，加入目标分子Hsp90。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育30分钟。然后吸去含有目标分子的溶液，用50微升1×PBS冲洗三次。

从芯片中吸除1×PBS溶液，加入50 µL的淬灭液1。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸除淬灭液1，加入50 µL的淬灭液2。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。随后，从芯片中吸除淬灭液2，用50 µL的1×PBS溶液清洗芯片五次，最后一次留一滴PBS在传感器上。

在所需的浓度范围内配制Cdc37的分析物稀释系列。实验设计应包含至少八个不同的分析物浓度，以获得可靠的解离常数（K_d值），并将这些不同稀释液与校准液和靶蛋白使用相同的缓冲液进行配制。

将芯片小心放入仪器中。确保软件已开启且 LED 指示灯变为绿色。接着，在自动化软件中点击“运行实验”模块，并选择“10 个点带再生”或其他所需方案。填写相关信息，例如操作者姓名、实验名称、日期、再生缓冲液、固定化靶标以及溶液中的分析物。点击软件上显示的“开始实验”按钮，并按照自动化软件提示的步骤进行操作。

为进行仪器校准，从芯片中吸取剩余的 PBS 溶液，并加入 50 微升校准缓冲液。按下 “继续” 按钮，等待五分钟，直至校准步骤完成。软件将显示校准步骤确定的终点，并发出警告警报以提示后续操作。

接下来，通过从芯片中吸取校准缓冲液并加入50微升最低浓度的分析物，进行分析物结合步骤。按下“继续”按钮，等待五分钟，直至结合步骤完成。软件将以警告提示音显示结合步骤的终点，提示继续操作。

为进行分析物解离，从芯片中吸出分析物溶液，并加入50 µL解离缓冲液。按下“继续”按钮。解离步骤持续时间结束后，软件将显示解离步骤的终点，并发出警告报警。

接下来，通过从芯片中抽吸解离溶液并加入 50 µL 再生缓冲液来执行芯片再生。然后，按下 “继续” 按钮。再生步骤通常需要约 30 秒完成。之后，软件将显示再生步骤的终点，并随之发出警告警报以提示后续操作。

最后，从芯片中吸出再生溶液以清洗芯片，并加入 50 µL 洗涤缓冲液。吸出芯片中的溶液，重复此步骤五次。最后一次保留洗涤缓冲液的一滴在芯片上。然后，按下 “Continue” 按钮，等待 30 秒，直至软件界面显示洗涤步骤完成。

对所用的每种分析物浓度重复上述步骤。校准、分析物结合、解离、再生以及清洗各五次，构成一个循环。