脱髓鞘动物模型中通过磁激活细胞分选法分离小鼠原代小胶质细胞

本方案有助于从成年小鼠脑组织显微解剖的脱髓鞘病灶中分离小胶质细胞，以研究体内小胶质细胞的特性。该技术节省时间，对实验人员和设备的要求较低。该方法有助于从动物脑组织中分离小胶质细胞，特别是处于各种疾病状态下的显微解剖组织。

在体视显微镜下，首先对胼胝体周围经中性染料标记的病灶进行显微解剖。将解剖所得组织在300 × g条件下离心30秒，使样本沉降至管底。将酶混合液一和酶混合液二置于37 °C培养箱中预热。

然后，向一个样本中加入 1,950 微升预热的酶混合液一，在 37 摄氏度的培养箱中孵育 5 分钟进行消化。加入 30 微升预热的酶混合液二，轻轻混匀。消化完成后，向离心管中加入 4 毫升预冷的 PBS，轻轻振荡。

将组织样品在4°C条件下以300 × g离心10分钟，然后缓慢而彻底地吸除上清液。用1,550 µL冷的PBS轻柔重悬细胞沉淀。加入450 µL冷的去碎片溶液，并充分混匀。

使用 1,000 微升移液器，缓慢而轻柔地向混合物中加入 2 毫升冷 PBS。离心混合物，然后观察三层结构。使用 1,000 微升移液器完全吸除最上两层，并用冷上样缓冲液将试管补至 5 毫升。

轻轻倒置离心管三次。接下来，离心后吸除上清液，用90 µL上样缓冲液重悬细胞沉淀，并加入10 µL CD11b磁珠。充分混匀后，在4 °C下孵育15分钟。

孵育后，加入1毫升上样缓冲液，用1,000微升移液器轻轻吹打液体上下混合，洗涤细胞。在4摄氏度下以300 × g离心10分钟，彻底吸除上清液以去除未结合的磁珠。将细胞重悬于500微升上样缓冲液中，将用于阳性筛选的MS分离柱及其分隔器置于磁场中。

根据制造商的说明书，用 500 微升的上样缓冲液冲洗色谱柱，以保护细胞并确保磁性分选的效率。将细胞悬液加至 MS 柱上，并弃去含有未标记细胞的穿流液。加入 500 微升的上样缓冲液洗涤色谱柱，然后将其从分离器上取下。

将柱子置于15毫升离心管上，向柱中加入1毫升上样缓冲液。最后推动柱塞至柱子底部，以洗脱磁标记的细胞。此处展示了在磁性激活细胞分选前后，对从成年小鼠脱髓鞘病灶中分离的小胶质细胞进行流式细胞术分析时所用门控策略的示意图。

图形图像表示用于选择细胞的前向散射高度和侧向散射高度、用于选择单细胞的前向散射面积和前向散射高度，以及用于选择髓系细胞和小胶质细胞的CD11b-FITC和CD45-APC。经磁激活细胞分选后，小胶质细胞的比例显著增加。该图形图像表示在磁激活细胞分选后，对活细胞和死细胞中的单细胞进行流式细胞术分析时所采用的设门策略。

此处使用7-氨基放线菌素D和侧向散射光高度来筛选活细胞。在进行该操作时，请记住根据中性红标记，在体视显微镜下精确地显微解剖脱髓鞘病灶。