利用磁性激活细胞分选法从小鼠脑部脱髓鞘病变中分离小胶质细胞

从小鼠脑的胼胝体中分离染色的脱髓鞘病灶。

这些病灶中含有表达细胞表面整联蛋白 CD11b 的脑内常驻小胶质细胞。

收集组织，并加入含有蛋白酶和DNase的溶液。

该酶可降解细胞外基质，而DNase可降解游离DNA。

加入冷缓冲液，并通过滤网过滤悬浮液以去除细胞团块。

离心，弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于密度梯度介质中。

加入缓冲液覆盖并离心，以收集上层残留的碎片；完整细胞则沉降至底部。

去除碎片，并将细胞重悬于缓冲液中。

加入抗 CD11b 磁珠以标记小胶质细胞。

将细胞上样至含有铁磁性微球的层析柱中，该层析柱置于磁力分离器的磁场内。

在外加磁场作用下，与磁珠结合的小胶质细胞被保留在柱中，而未结合的细胞则流过柱子。

将柱子从磁场中取出。加入缓冲液以洗脱小胶质细胞。

在体视显微镜下，首先对胼胝体周围经中性染料标记的病灶进行显微解剖。将解剖所得组织在300 × g 条件下离心30秒，使样本沉降至管底。将酶混合液1和酶混合液2在培养箱中预热至37摄氏度。随后，向一份样本中加入1,950微升预热的酶混合液1，在37摄氏度培养箱中消化5分钟。加入30微升预热的酶混合液2，轻轻混匀。

消化后，向试管中加入 4 毫升冷 PBS，轻轻振荡。将组织样本在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟，然后缓慢而彻底地吸除上清液。用 1,550 微升冷 PBS 轻柔重悬细胞沉淀。加入 450 微升冷去碎片溶液，充分混匀。

使用1000微升移液器将2毫升冷PBS非常缓慢且轻柔地叠加到混合物上。离心混合物，然后观察3层结构。使用1000微升移液器完全吸出上层的两层液体，并用冷上样缓冲液将试管补至5毫升。轻柔地将试管倒置3次。

接下来，离心并吸除上清液后，用90微升缓冲液重悬细胞沉淀，并加入10微升CD11b磁珠。充分混匀，在4摄氏度孵育15分钟。孵育结束后加入1毫升缓冲液，用1000微升移液器轻轻吹打液体上下混合，洗涤细胞。

在4:00摄氏度条件下，以300 × g 离心10分钟，完全吸除上清液以去除未结合的磁珠。将细胞重悬于500微升上样缓冲液中，并将用于阳性筛选的MS柱及其分离器置于磁场中。用500微升上样缓冲液冲洗柱子，以保护细胞，并确保根据制造商说明书高效完成磁式分选。

将细胞悬液加入MS柱中，弃去含有未标记细胞的流穿液。加入500 µL上样缓冲液洗涤柱子，然后从分离器上取下。将柱子置于一个15 mL离心管上，并向柱中加入1 mL上样缓冲液。最后，将推杆推至柱子底部，以洗脱磁标记的细胞。