一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

基于荧光的膜电位检测方法为研究调节剂对上皮细胞内源性表达的离子通道的影响提供了可靠的技术手段。作为概念验证，我们正在两种经典的上皮细胞系中检测两种离子通道的功能。该检测方法具有良好的通用性，因其采用外源性化学探针来测量离子通道功能，从而避免了使用基因编码探针的需要。

这些高通量检测方法可用于鉴定和表征小分子调节剂对离子通道的作用，有望推动囊性纤维化的治疗。首先，在含有 EMEM 培养基的 T75 培养瓶中培养 Calu-3 和 Caco-2 细胞，培养基中添加 20% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。当细胞达到 80% 至 100% 汇合度后，吸除 T75 培养瓶中的培养基。

用 10 毫升磷酸盐缓冲液轻轻洗涤细胞。然后，向细胞单层中加入 2 毫升预热的含有 0.1% EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶。将培养瓶置于 37 °C 下约 5 分钟。

在此步骤中，确保细胞从培养瓶表面脱落并解离成单细胞悬液。加入 8 毫升培养基以中和反应。当细胞达到 30% 至 40% 汇合度时，将 1.5 毫升细胞悬液加入含有 18.5 毫升培养基的锥形管中，并混匀。

向96孔板的每个孔中加入200微升该细胞悬液，使每孔约含140,000个细胞。若要接种一个完整的384孔板，将1毫升细胞悬液加入含有17毫升培养基的锥形管中，使每孔约含50,000个细胞。混匀后，向每个孔中加入50微升细胞悬液。

每两天更换一次培养基，确保所有孔中的细胞在三到五天内同时达到100%汇合度。在功能研究前24小时更换培养基。首先，根据文本方案中列出的试剂配制无钠、无氯缓冲液。

将试剂加入组织培养级的双蒸水中，室温下搅拌过夜，使试剂充分溶解。待溶液稳定后，逐滴加入1摩尔NMDG溶液，调节pH至7.4。

混合30分钟，并将溶液的渗透压调节至300 ± 5 毫摩尔/千克。过滤后将缓冲液储存于无菌瓶中。然后，将0.5毫克膜电位染料溶解于1毫升无钠、无氯缓冲液中，并将溶液加热至37摄氏度。

移除 Calu-3 和 Caco-2 单层细胞的培养基。对于 96 孔板，每孔加入 195 微升染料溶液；对于 384 孔板，每孔加入 95 微升染料溶液。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 35 分钟，使细胞负载染料。

然后，在激发波长530纳米、发射波长560纳米的条件下进行荧光检测。首先，以30秒为间隔，连续记录5分钟的基础荧光值。随后，向96孔板的每个孔中加入5微升浓度为400微摩尔的佛司可林（Forskolin）溶液，使佛司可林的终浓度达到1微摩尔。

对于384孔板，加入5微升20微摩尔的佛司可林溶液。以15秒为间隔，进行20分钟的刺激读数。接着，向96孔板中加入5微升400微摩尔的CFTR抑制剂溶液，使终浓度达到10微摩尔。

向384孔板中加入5微升200微摩尔的CFTR抑制剂。以30秒为间隔，进行15分钟的抑制读数。量化每个孔的荧光强度测量值，并将数值导出为电子表格。

以列格式排列，包含单独的孔。为计算Forskolin诱导的变化，将96孔板中每个孔的相对荧光单位测量值除以基线读数的最后一次荧光强度测量值，并绘制结果。峰值反应定义为Forskolin刺激期间相对于基线测得的最大荧光强度。

使用该测量值或曲线下面积来定量CFTR反应。在Caco-2细胞中，CFTR功能表现为佛司可林刺激后细胞膜去极化。与以DMSO作为溶剂对照相比，氟离子外流表现为荧光信号的急剧增加。

福斯科林刺激后，荧光信号持续存在，直至加入CFTR抑制剂后，荧光强度迅速下降。该现象在Caco-2和Calu-3细胞中均可重复观察到。CFTR活性计算为福斯科林或DMSO刺激后荧光最大变化值的差值。

在佛司可林刺激和DMSO对照情况下，各个数据点均位于均值上下3个标准差范围内，表明该检测方法具有良好的可重复性。为确认功能反应的特异性，可进一步采用传统的电生理学方法（如Ussing腔室）对这些膜电位检测进行验证。该平台能够弥合高通量调节剂筛选与异源表达系统以及难以获取的原代组织中耗时的生物电测量之间的差距。