实时测量完整功能性膜蛋白的核苷酸结合

由于ATP是一种重要的细胞信使，我们开发了一种能够高精度测量ATP与其受体结合的方法。通过核苷酸衍生物与荧光标记蛋白之间的荧光共振能量转移（FRET），我们可以实时监测核苷酸与完整功能受体的结合，并具有优异的空间分辨率。我们利用该方法研究细胞代谢对ATP敏感性钾通道的影响，该通道与某些类型的糖尿病相关。

进行去包膜膜实验时，首先使用镊子从转染细胞的盖玻片上取下一小片碎片，并用 PBS 冲洗该碎片。如果盖玻片预先涂有聚赖氨酸，则将碎片置于含有 2 毫升 PBS 的 35 毫米培养皿底部，并将直径 3 毫米的探头超声仪置于样品上方 3 至 5 毫米处，以 50 瓦功率、20% 至 40% 振幅脉冲处理 200 至 500 毫秒，以去除细胞包膜。若盖玻片未预先包被，则在 PBS 冲洗后，将碎片浸入含有 0.1% 聚-L-赖氨酸的离心管中约 30 秒，随后如上所述通过短时超声处理去除细胞包膜。

将超声处理后的片段转移至含有2毫升灌流液、带盖的35毫米玻璃底培养皿中，并将培养皿安装在倒置显微镜上，显微镜配备高数值孔径60倍水浸物镜。检查显微镜的相机接口是否已串联连接至光谱仪和高灵敏度CCD相机，并使用蠕动泵以每分钟0.5至1毫升的流速向灌流室持续灌注缓冲液。为鉴定表达ANAP标记通道的去包被膜片段，请观察样品，定位含有荧光通道的膜结构。

将光谱仪掩膜部分插入显微镜的相机端口与光谱仪之间。掩膜的阴影将出现在相机图像上。获取去顶膜的明场和荧光图像，以供选择用于分析的感兴趣区域。

将微体积灌流系统的尖端靠近去除了上覆结构的膜。为获取ANAP荧光图像，通过390/18纳米带通激发滤光片和416纳米边缘二向色镜，使用385纳米LED激发膜，并通过400纳米长通发射滤光片收集发射光。启用光谱仪掩模，并确保发射光通过。

将目标区域与光谱仪狭缝的狭口对齐。启动光谱仪光栅。当光栅就位后，光谱仪衍射的光将投射到CCD相机的芯片上，生成光谱图像。

图像将保留Y维度的空间信息，X维度将被波长取代。在用不含核苷酸的缓冲液灌注时，获取一个或多个0.1至10秒的曝光图像，用于后续对实验其余部分所收集数据的校正和归一化处理。

接下来，在浴液中施加一系列不同浓度的TNP ATP，以建立浓度-反应曲线，每种溶液灌注至少一分钟，以确保达到稳态，并为每个浓度获取一次曝光图像。每次施加浓度后，用不含核苷酸的浴液冲洗TNP ATP至少一分钟，然后采集处理后的曝光图像。进行膜片钳荧光实验时，首先将厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管拉制为膜片电极，当电极内充满电极溶液时，其电阻应为1.5至2.5兆欧。

接下来，将带有转染细胞的盖玻片转移至含有两毫升灌流液的玻璃底35毫米培养皿中，并将培养皿安装到倒置显微镜上。用灌流液持续灌注浴槽，找到表达ANAP标记通道的细胞。对膜片钳电极施加轻微正压，并将电极置入浴槽中。

将移液管轻压在细胞膜上，并施加轻微负压以形成吉欧姆封接。为分离膜片，迅速将移液管 holder 从已封接的细胞移开。将膜片移液管的尖端靠近灌流系统的尖端，并确认膜片位于光谱仪遮罩的狭缝内。

然后施加TNP ATP并采集图像光谱。在这些图像中，可以观察到一个典型的来自表达橙色荧光蛋白标记的ATP敏感性钾通道的HEK293T细胞的去包被膜片段。在此来自暴露于5 µM TNP ATP的HEK293T细胞去包被膜中ANAP标记的ATP敏感性钾通道的光谱图像中，可观察到两个高强度区域，分别对应于ANAP和TNP ATP的峰值发射。

通过从平均的目标区域光谱中减去平均的背景光谱，可获得最终光谱。此处可以观察到多次曝光后ANAP荧光峰值的降低。在无TNP ATP存在的情况下，多次曝光得到的荧光峰值拟合为单指数衰减曲线。

随后利用这些数据校正光漂白伪影。此处展示了表达ANAP标记的ATP敏感性钾通道的细胞去顶膜后，在无TNP-ATP和有TNP-ATP条件下获得的代表性光谱图像。观察校正后的发射光谱，可清晰分辨出供体与受体荧光发射峰的分离。

本图展示了典型的膜片钳荧光测定实验中，标记了ANAP的ATP敏感性钾通道的代表性电流和光谱。发射光谱已针对背景信号和漂白效应进行了校正，校正方法与去顶膜实验中所示相同。请注意设置对照，以验证荧光信号特异性来源于您的受体。

确保转染快速、高效且完全，并尽量缩短曝光时间。该方法可解答关于受体占据及其与功能关系的问题。采用类似装置的其他FRET技术可用于探究配体诱导的受体构象变化。