利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

本方法的总体目标是利用荧光间隔检测法对膜蛋白的细胞表面表达进行定量分析。该技术的主要优势在于，流式细胞术检测可在单次实验中对大量活细胞提供可量化的终点数据。该技术的应用意义延伸至心脏室性心律失常的诊断与治疗，因为这些疾病通常与导致心脏离子通道转运缺陷的遗传突变相关。

通常，初次接触该方法的研究人员难以确定一个合适的外向插入位点用于表位标签，该位点既不会影响蛋白质功能，又能在结合偶联抗体后产生强烈的荧光信号。本实验操作将由本实验室的研究助理 Benoite Bourdin 演示。首先，在细胞内 C 末端处用 mCherry 对 DNA 构建体进行双重标记。

此外，表达一种细胞外侧的血凝素表位，可通过荧光抗体检测来估算膜蛋白在细胞表面的表达水平。接下来，采用标准技术培养一板TSA201细胞，直至细胞融合度达到90%。每个样本分别在两个试管中准备转染试剂。

准备一个1.5毫升离心管，其中加入4微克DNA和250微升低血清培养基；另准备一个离心管，加入10微升脂质体介导转染试剂和250微升低血清培养基。轻轻混匀两个离心管中的内容物，并在室温下孵育5分钟。随后，将第一个离心管和第二个离心管中的溶液轻柔混合，室温下孵育20分钟，以形成脂质体-DNA复合物。

将复合物加入培养的细胞中，轻轻摇动培养皿。将培养皿放回37摄氏度、5%二氧化碳的环境中培养24小时。转染试剂加入24小时后，从培养皿中移除培养基，并用400微升预热的胰蛋白酶-EDTA小心洗涤细胞。

然后，加入 400 µL 胰蛋白酶-EDTA，将培养皿孵育 5 分钟，使细胞从培养皿表面脱落。细胞脱落后，加入 1 mL 不含青霉素和链霉素的冷培养基以终止酶消化反应。轻柔吹打培养基 4 至 5 次，使所有细胞从培养表面完全脱离。

然后，将细胞收集到无菌的 1.5 毫升离心管中，并立即置于冰上。后续步骤中使用预冷的溶液，并将细胞保持在 4 摄氏度，以防止表面表位的内化。同时，减少细胞暴露于光线下的时间，以尽量减少荧光信号的光漂白。

接下来，离心试管以沉淀细胞。然后，小心吸除并弃去上清液。用一毫升 PBS 重悬沉淀，制备单细胞悬液。

然后，短暂离心试管。再次沉淀并重悬细胞，以彻底去除培养基。接着，将细胞沉淀重悬于 600 µL PBS 中。

测定细胞浓度，并将其调整至每毫升至少三百万个细胞。然后将细胞分装到新的1.5毫升离心管中。务必设置适当的对照，以区分特异性染色与非特异性染色，以及用于细胞外染色和细胞内染色的对照。

同型对照抗体将用于评估背景染色水平，应与一抗的同型、理想的同位素及荧光素相匹配。使用同型对照抗体和荧光抗体时，必须保持相同的浓度。为评估膜蛋白的细胞表面表达水平，首先使用荧光标记抗体对细胞外侧的HA表位进行标记。

然后，向试管中加入终浓度为每毫升5微克的FITC标记的单克隆抗HA抗体。短暂涡旋混匀细胞，随后在避光条件下于摇床中孵育。将细胞从避光环境中取出，加入900微升PBS。

然后离心试管以沉淀细胞，并吸除上清液。接着，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，并短暂涡旋混匀。随后，再次进行离心步骤以重新沉淀细胞。

重复此洗涤步骤共三次，以去除任何未结合的抗体。最后一次洗涤后，将细胞重悬于500 µL PBS中，并将单细胞悬液转移至5 mL流式细胞术管中。将细胞置于4°C避光保存，直至上机检测。

为了评估细胞内总蛋白的表达水平，接下来对已通透的细胞进行标记。该步骤采用与细胞外标记相似的方案，但需使用含皂苷的细胞通透缓冲液。将细胞离心形成沉淀，弃去上清液，然后直接用100 µL预先配制好的固定-通透溶液重悬细胞。

将细胞在 4 摄氏度避光孵育 20 分钟。然后加入 100 µL 新鲜配制的通透洗涤缓冲液，短暂涡旋混匀细胞。接着，离心收集细胞，并用通透洗涤缓冲液再洗涤两次。

然后，加入终浓度为每毫升5微克的FITC标记单克隆抗HA抗体以及100微升通透洗涤缓冲液。轻轻涡旋混匀细胞，并在4摄氏度避光孵育30分钟。接着，加入100微升通透洗涤缓冲液。

将细胞离心成团，并用与之前相同的缓冲液各100微升洗涤三次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于500微升PBS中，并将单细胞悬液转移至5毫升流式细胞术管中。于同一天内分别对未透化和透化的细胞进行流式细胞术检测。

首先，启动流式细胞术分析软件，并导入流式细胞术实验过程中生成的 fcs 文件。点击第一个样本，开始在侧向散射光对前向散射光的图谱中进行设门。接下来，使用椭圆工具在活细胞周围绘制 P1 门，以去除碎片、死细胞或聚集体。

然后，绘制 mCherry 与 FITC 荧光强度的管参数轮廓图。将 P2 门设置在 FITC 和 mCherry 阳性细胞周围，将 P3 门设置在荧光阴性细胞群周围。接着，选择 P2 和 P3 门，点击原始工作区窗口中的添加统计图标。

点击“计数”，然后点击“均值”。最后，将门控参数和统计结果应用于流式细胞仪检测的所有样本。本方案用于表征N-糖基化对TSA201细胞中CaV Alpha 2 Delta 1的总表达及细胞表面表达的作用。

为了检测细胞表面蛋白表达，对未破膜细胞中N-糖基化位点在四个位点、十六个位点或无位点处发生破坏的细胞进行了HA标记的测量。在野生型细胞以及N-糖基化位点在四个位点被破坏的细胞中，FITC信号较强；而在N-糖基化位点在十六个位点被破坏的细胞中，仅检测到背景水平的信号。对于破膜处理的细胞，所有条件下的FITC荧光均增强，表明所有转染的、带有HA标签的CaV Alpha 2 Delta 1蛋白均被抗HA-FITC抗体染色并检测到。

此外，破膜细胞与未破膜细胞的mCherry荧光水平相似，表明破膜处理并未改变相对的mCherry信号。在细胞破膜后进行的检测显示，16个定位位点被破坏的细胞总蛋白表达量也显著降低，无论该结果是基于破膜细胞中的FITC荧光，还是基于未破膜及破膜细胞中检测到的组成型mCherry荧光得出的。除了该实验步骤外，还可进行额外的生理记录实验，以关联离子通道的表达与功能。

该技术还为医学领域的研究人员提供了研究遗传突变、翻译后修饰、微小RNA、小GTP酶以及分子伴侣在重组或天然细胞中表达的膜蛋白运输过程中的作用的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何在重组细胞中进行DNA转染、对NTAC及透化细胞进行染色，以及如何对样品进行数据分析。请务必注意，操作活细胞时需要采取预防措施，例如在转染过程中于层流罩内操作，并在接触化学试剂时佩戴手套。