利用多重荧光染色与组织透明化技术展示三维模式下有毛与无毛皮肤的神经支配

本方案提供了一种可行的方法，利用共聚焦显微镜观察同步切片，从而确保对神经纤维的观察具有高精度。该技术的主要优势在于组织清洗步骤简单易行。组织清洗过程高效，耗时约为30分钟至1小时。

按照文稿中所述，对已实施安乐死的大鼠进行灌注。使用手术刀去除后肢足部背侧和足底的皮肤。对于需要制备冷冻切片的样本，将组织在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中的4%甲醛中后固定两小时。

洗涤后，将皮肤组织包埋于37摄氏度的2%琼脂糖中，随后放入冰盒中冷却。用冰水将包埋好的组织固定在振动切片机上，沿横向切成500微米厚度的切片。切片完成后，从组织切片中去除琼脂糖，并将其置于六孔板中，用1×PBS保存。

将组织切片在含有2% Triton X-100的1×PBS溶液中4°C下孵育过夜。将组织切片放入封闭缓冲液中，在摇床上以每分钟72转的速度于4°C旋转孵育过夜。将组织切片转移至含有小鼠单克隆抗CGRP抗体和绵羊多克隆抗LYVE-1抗体的稀释缓冲液溶液中，置于微量离心管内。

然后在4°C条件下于摇床中旋转孵育两天。用洗涤缓冲液在室温下洗涤组织切片两次，随后将组织切片置于洗涤缓冲液中，在4°C摇床上继续孵育过夜。次日，将组织切片转移至含有二抗的混合溶液中，放入微量离心管内，在4°C、72转/分钟的摇床中旋转孵育5小时。

用洗涤缓冲液在六孔板中于室温下洗涤组织切片，每次一小时，共洗涤两次。将组织切片置于洗涤缓冲液中，于4°C在摇床上过夜孵育。将组织切片转移至组织透明试剂中，于室温下在摇床上以每分钟60转的转速轻轻旋转孵育一小时。

将透明化组织置于载玻片上，然后用间隔垫圈围绕组织，并用新鲜的组织透明试剂封固间隙，盖上盖玻片。三维结构显示，CGRP阳性神经纤维穿过皮下组织和真皮层，延伸至表皮层。这些神经纤维在皮下组织中成束走行，在真皮层内分支，最终终止于表皮层。

相比之下，肌动蛋白结合蛋白phalloidin阳性的血管和LYVE-1阳性的淋巴管分布于皮下组织和真皮层。通常，CGRP阳性的神经纤维与血管和淋巴管平行走行或包绕其周围，在有毛和无毛皮肤中形成三维网络结构。采用传统方法时，尽管在薄切片中神经纤维、血管和淋巴管可通过CGRP、phalloidin和LYVE-1清晰标记，但这些结构的观察受限于切片厚度，无法实现完整观察。

在厚度为30微米的切片中，有毛皮肤与无毛皮肤的CGRP阳性神经纤维表面积之间无差异。在厚度为300微米的组织切片中，与有毛皮肤相比，无毛皮肤的CGRP阳性神经纤维表面积显著增加。抗体孵育后，使用高渗透压的清洗缓冲液非常重要。

免疫荧光染色过程中，需要进行多次清洗步骤。按照本方案操作，我们相信该方法也有望用于其他组织和器官的六部分切片染色与观察。该技术可帮助神经科学研究人员分析神经纤维的表面积及其状态。

它还有助于我们观察组织和器官的形成过程。