一种用于微蛋白鉴定与序列分析的整合方法

本文所述方案提供了在用户友好的 UCSC 基因组浏览器上利用 phyloCSF 分析目标基因组区域蛋白质编码潜力的详细操作指南。phyloCSF 能够有效识别当前注释为非编码区域中具有微蛋白编码潜力的保守短开放阅读框。本文描述的方法操作简便，无需生物信息学或比较基因组学背景或专业知识，各类研究背景的科研人员均可轻松实施。

首先，打开一个互联网浏览器窗口，访问加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器。在“我们的工具”标题下，选择“track hubs”选项。在“公共hub”标签页的搜索框中输入 phyloCSF。

然后，点击“搜索公共中心”按钮。通过点击名为 phyloCSF 的中心对应的连接按钮，连接到 phyloCSF。点击连接后，请等待页面跳转至 UCSC 基因组浏览器网关页面。

若要查询其他物种，请在“浏览或选择物种”标题下点击相应的图标以选择目标物种，或在提示“输入物种常用名或基因组组装ID”的文本框中输入物种名称。使用下拉菜单在“定义位置”标题下选择要搜索的基因组组装版本，然后在“位置或搜索词”框中输入位置、基因符号或搜索关键词，点击“前往”按钮，以在基因组浏览器中定位目标基因。如果搜索结果返回多个匹配项，请等待页面跳转至需要选择特定位置的页面，然后点击相应的目标基因。进入UCSC基因组浏览器后，在“我们的工具”标题下选择“类似BLAST的比对工具”（BLAT），以查询特定的DNA或蛋白质序列。

或者，将光标悬停在工具选项卡上，选择 blat 选项，或点击提供的链接。在下拉菜单中选择感兴趣的物种、基因组和组装版本。然后，定义查询类型，将感兴趣的序列粘贴到 blat 搜索基因组文本框中，然后点击提交。

接下来，点击“操作”标题下的浏览器链接，导航至目标基因组区域。在目标基因组区域内目视扫描具有正得分的 phyloCSF 区域。使用缩放功能放大感兴趣的区域，以检查序列特征，并搜索起始密码子和终止密码子。

手动放大时，按住 Shift 键，同时点击并按住鼠标按钮，沿目标区域拖动。或者，使用页面顶部的放大和缩小按钮进行导航。持续放大直至核苷酸或碱基序列清晰可见。

在正得分的 phyloCSF 区域的起始和末端附近，目视扫描核苷酸序列，以识别潜在的起始密码子和终止密码子。将鼠标悬停在页面顶部的视图标题上，点击“在其他基因组中转换”选项，然后在新基因组标题下方的下拉菜单中选择目标基因组。在新组装标题下选择感兴趣的基因组组装版本，然后点击提交按钮。

当浏览器返回新组装结果中具有相似性的区域列表后，点击染色体位置链接，以导航至同源的目标区域。按照前文所述的导航策略，对序列进行分析。

要导航至基因描述页面，请在 UCSC 基因组浏览器的基因编码轨迹中点击感兴趣的基因。在“序列及工具与数据库链接”标题下方，点击表格中显示为“其他物种（更快）”的链接。勾选与目标物种相关的复选框以选择这些物种。

然后，点击提交。将页面底部以更快格式显示的序列复制并粘贴到文字处理文档中。接着，打开第二个浏览器窗口，并访问欧洲生物信息研究所网站上的 Clustal Omega 多序列比对工具。

将剪贴板中的序列文件粘贴到第一步中标注为“以任何支持的格式输入序列”的框中。滚动至页面底部并点击提交。在下方比对结果中观察符号，这些符号表示每个氨基酸保守程度的高低。

要查看氨基酸的性质并进行着色，请点击序列正上方的“显示颜色”链接，以根据氨基酸的性质对其进行着色。然后将序列比对结果复制并粘贴到文字处理或幻灯片演示程序中，以生成图表或插图文件。如需查看Clustal Omega结果页面的其他输出内容，请点击“引导树”或“系统发育树”标签页。

最后，单击结果查看器的选项卡，以使用 Jalview 查看序列信息，或访问 mview 和简单系统发育分析的直接链接。对 mitoregulin 基因进行的代表性 phyloCSF 分析表明，存在一个与已验证的微蛋白相对应的高序列保守区域。完整的 mitoregulin 编码序列位于第一外显子内，在 phyloCSF 负一轨道上的得分非常高。

在 phyloCSF 负一轨道中，正得分区域的起始位置可以观察到一个保守的起始密码子。Mitoregulin 第一个外显子中的正得分区域直接起始于一个起始密码子，并在终止密码子处结束。此处展示了八种不同物种的微蛋白 mitoregulin 的多序列比对结果。

对长链非编码RNA hot air的分析显示，在全部六个读数轨道上，该基因的整个区域均呈现负分值，表明其序列缺乏保守性，支持hot air被正确注释为非编码RNA。对小鼠one, eight, one, zero, zero, five, eight, I 24 rike基因的PhyloCSF分析显示，一个保守的开放阅读框跨越了三个外显子，其正向PhyloCSF分值从外显子一的+2轨道跃升至外显子二的+3轨道，随后又回到外显子三的+2轨道。对meet one基因位点的PhyloCSF分析也被有效用于识别单个RNA分子内多个不同的编码开放阅读框。

需要注意的是，尽管较高的phyloCSF得分强烈提示存在微蛋白编码能力，但这一证据本身并不足以确证，必须通过实验加以验证。一旦鉴定出潜在的微蛋白编码区，即可对其氨基酸序列进行分析，以寻找保守结构域或序列特征，从而推测其功能。phyloCSF已成功用于在先前被认为是非编码的基因组区域中发现新的微蛋白，未来仍将是微蛋白鉴定研究中的有力工具。