用于无细胞重组的重组Septin复合物的纯化与质量控制

该方案能够纯化高质量的 septin 复合物，这对于研究 septin 在细胞中的多种功能至关重要。此方法的主要优势在于通过使用 Addgene 质粒，建立了一种简单且高效的 septin 纯化流程。由于 septin 在细胞内具有多种相互作用，因此对其进行研究较为困难。

通过在简单系统中研究，硫元素重构有助于我们解析这种复杂性。我们建议在一天内完成纯化，以防止降解。根据我们的经验，这将延长蛋白质的寿命并提高其质量。

首先，在37摄氏度的摇床培养箱中培养转化后的细菌培养物，直至其在600纳米波长下的光密度达到2至3（用于未标记的septin蛋白），或0.6至0.8（用于msfGFP或mEGFP标记的septin蛋白）。培养完成后，加入IPTG至终浓度为0.5毫摩尔，诱导蛋白表达：表达未标记septin异源寡聚体的细胞在37摄氏度继续培养3小时，而表达msfGFP标记异源寡聚体的细胞则在17摄氏度过夜培养。随后，在4摄氏度条件下以4,000 × g离心20分钟收集细胞沉淀。

弃去上清液，将沉淀物溶于100毫升裂解缓冲液中以裂解细胞。接着，使用探头超声仪在30%的振幅下对细胞进行超声处理。在4°C条件下，以20,000 × g离心30分钟，澄清细胞裂解液，并保留上清液。

可选步骤：按照文中的描述取样进行变性电泳。对于带有 His 标签的 Septin 蛋白的亲和层析，使用所有必需的缓冲液平衡预装的镍-Sepharose 高性能层析柱。将澄清后的上清液上样至层析柱，然后启动层析系统。

然后以每分钟1毫升的流速，用50% HisTrap洗脱缓冲液洗脱肌动凝蛋白复合物。为获得250毫摩尔的咪唑浓度，收集0.5毫升的组分。现在使用快速蛋白液相色谱系统在280纳米处监测洗脱液的光吸收，并选取含有肌动凝蛋白复合物的组分。

对于Strep-II标签蛋白的亲和层析，先用septin缓冲液平衡预装的StrepTactin Sepharose高效层析柱。以每分钟1毫升的流速上样从镍柱中回收的含septin组分，并启动层析系统。随后洗涤结合的蛋白，并以每分钟1毫升的流速用100% StrepTrap洗脱缓冲液洗脱septin复合物。

为了获得2.5毫摩尔的脱硫生物素浓度，收集0.5毫升的组分。根据高效液相色谱系统在线监测洗脱液在280纳米处的光吸收值，选取含有 septin 复合物的组分。通过透析去除脱硫生物素后，将蛋白质复合物分装至所需体积，迅速冷冻分装样品，并在-80摄氏度下保存。

对于干涉散射显微镜实验，将1.5号玻璃载玻片依次在超声波清洗机中用去离子水、异丙醇和去离子水中各超声清洗五分钟。用温和的氮气气流吹干两张玻璃载玻片。然后在其中一张载玻片中央滴加7微升0.01%的聚-L-赖氨酸溶液，并将另一张载玻片的中心置于该聚-L-赖氨酸液滴上，使两张载玻片呈正交方向放置，以便后续分离。

孵育30秒后，将玻片浸入盛有去离子水的烧杯中清洗一次，再直接用流水冲洗两次。用氮气流吹干，这些玻片可在室温干燥条件下保存约六周。实验前，裁剪一块2×2、3×2或3×3的垫圈，并将其粘贴到经多聚-L-赖氨酸处理的玻片区域，注意将玻片放置在轻质擦拭纸上，避免玻片和垫圈接触任何脏污表面。

现在用移液枪头按压垫圈，使其与垫圈上附带的保护塑料粘合。接着，将 septin 缓冲液升温至室温。将手中待用的蛋白质解冻，之后立即置于冰上保存。

然后将带有垫圈的载玻片放置于商用质量光度系统上，系统内含19 µL的septin缓冲液，并使用自动对焦功能调节显微镜焦距。使用新的设置，再次通过自动对焦功能重新对焦。要创建项目文件夹，请依次点击“文件”和“新建项目”；要加载用于存储数据的项目文件夹，请依次点击“文件”和“加载项目”。

然后用移液器将一微升样品加入19微升隔膜缓冲液滴中。混匀，混匀过程中避免接触任何物体，以防载玻片移动。随后点击“Record”按钮，录制一段6,000帧的视频。

使用制造商提供的软件分析视频，以获得蛋白质质量分布。如果不同大小的septin异源寡聚体峰重叠过多或检测到的事件过多，则降低septin终浓度后重新测量；当单分子计数不足时，提高septin浓度后重新测量。

进行 septin 分析时，准备 5X 暗SPB溶液和 septin 混合液，其中 septin 混合液包含100%暗标记 septin，其浓度为所需终浓度的六倍（溶于 septin 缓冲液中），并加入一毫摩尔的二硫苏糖醇。随后通过以下特定顺序混合：水、20% 5X 暗SPB 和 16.67% septin 混合液，以启动 septin 聚合，并在室温下孵育30分钟。取三至五微升样品滴加到经辉光放电处理的透射电镜载网上，孵育一分钟。

现在，加入一滴暗SPB缓冲液洗涤载网两次，并用滤纸吸去液体。再用蒸馏水洗涤一次，随后用2%醋酸铀染色30秒。接着，用滤纸吸去染液，将样品在空气中干燥数分钟。

然后在120千伏电压下，以5,000倍至60,000倍的放大倍数以及1至2微米的欠焦量对隔蛋白束进行成像。HisTrap和StrepTrap层析图谱显示，合并的组分分别从洗脱峰起始处持续至吸光度在约250毫升和50毫升处趋于稳定。变性凝胶电泳中的隔蛋白条带显示出相似的强度，表明隔蛋白保持完整。

在天然电泳中，观察到一条对应于完整异源寡聚体的主条带和一条对应于三聚体或四聚体的次要条带。标记了msfGFP的复合物的表观分子量与未标记复合物的表观分子量无法区分。质量光度法检测到了完整的八聚体和六聚体形式的septin蛋白。

在 241 千道尔顿处出现的额外峰表明存在两种花生蛋白，DSep1 和 mEGFP-DSep2。Septin 复合物的透射电子显微镜图像显示了六聚体和八聚体的杆状结构。在 septin 2 msfGFP 人源 septin 八聚体_9i1 中，msfGFP 标签在两端呈现为模糊的密度区域。

在浅层TIRF场中可观察到小的蛋白质簇。共聚焦显微镜揭示了大量漂浮的丝状结构聚集体。透射电子显微镜显示了与全内反射荧光显微镜和共聚焦显微镜观察到的聚集体相对应的小型和大型 septin 束。

我们建议在纯化过程中的所有步骤均在冰上操作，并添加本方案中指定的新鲜试剂。我们的研究关注有丝分裂背景下 Septin 蛋白之间的相互作用。为了通过显微镜及多种生物物理实验进行研究，我们已将 Septin 与现代膜结构、肌动蛋白和微管共同重建。

我们利用纯化的 septin 蛋白研究其与肌动蛋白丝、微管以及脂质的相互作用。同时，我们还利用纯化的 septin 构建合成细胞，在其中 septin 促进细胞分裂。