使用串联亲和标签法纯化用于结构研究的天然复合物

本实验方案的总体目标是纯化出适合进行生物物理研究的高质量天然大分子复合物。该方案不仅提供了一种纯化复合物的方法，还详细指导了在纯化过程中如何评估样品的结构质量。本方案的主要优势在于，能够在接近生理条件的缓冲体系中，简单而快速地纯化出天然组装的复合物，从而确保其组成均一性。

按照文本方案，将酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞离心并倾去上清液后，加入2毫升预冷的裂解缓冲液，轻轻涡旋或使用10毫升血清移液管吹打以重悬沉淀。将细胞悬液转移至一个预先置于冰上的空的50毫升锥形聚丙烯离心管中。然后用额外的2毫升预冷裂解缓冲液冲洗每个离心瓶，并将洗涤液一并加入50毫升离心管中。

在测定细胞沉淀的湿重后，于一个50毫升锥形聚丙烯离心管内及周围制备液氮浴。接着，将悬浮细胞吸入一支5毫升注射器中，并在注射器上连接一根16号针头。然后，以大约每分钟1毫升的速度将细胞悬液通过注射器和针头滴入液氮浴中，使悬液形成液滴并迅速冷冻。

为了裂解酵母细胞，首先使用液氮预冷一台咖啡研磨机。然后加入最多40克酵母细胞，研磨25秒，重复研磨八到九次。建议每次纯化不要超过10升的细胞培养物。

这可以最大限度缩短纯化时间，并确保复合物的结构完整性得以维持。每研磨两轮后，向研钵中加入一层少量液氮，待其完全挥发。为防止细胞结团，需使用经液氮预冷的刮勺不断搅拌细胞，以避免细胞解冻。

裂解后，细胞应呈现为细小的白色粉末。根据文本方案，在检查细胞裂解情况并配制含有PMSF、DTT和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液后，使用经液氮冷却的刮勺，逐步将冷冻的裂解细胞粉末舀入已准备好的50毫升缓冲液离心管中。每次加入粉末后，轻轻旋转50毫升离心管（置于室温），以使细胞逐渐解冻并溶解，同时防止气泡产生。

随着细胞溶解，继续添加更多细胞粉末。待所有细胞加入后，持续解冻并溶解细胞，直至试管中观察不到任何冻存的细胞团块。此过程大约需要50分钟。

接下来，将细胞裂解液在 25,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。细胞裂解并完成离心后，可能在不溶性沉淀中观察到一层少量的深色物质。将上清液转移至聚碳酸酯超速离心管中，并向每根装满的离心管中加入 10 µL 的 200 mmol/L PMSF。

将样品在 100,000 × g、4 °C 条件下离心 1 小时。离心结束后，应可见四层：一个坚硬透明的沉淀，主要含有核糖体复合物；一个柔软、富含脂质的沉淀；一个较大的透明微黄色层，含有细胞中大多数可溶性蛋白质和复合物；以及一个由脂质组成的鳞片状顶层。

在4摄氏度的低温房间内，使用1毫升移液器尽可能去除上层的鳞片状脂质层，并弃去。使用10毫升血清移液器回收大部分澄清的黄色层。然后，使用1毫升移液器小心回收该层最后几毫升液体，避免扰动底部的两层。

从40克湿菌体沉淀中，通常可回收约48毫升中间层。根据文本方案制备IgG Sepharose后，将IGG树脂与中间相上清液以及每40克细胞加入两片迷你蛋白酶抑制剂片剂混合，然后于4°C在旋转仪上孵育两小时。

这是IgG批次溶液。通过剪切柱子的末端以形成一个平整的开口，准备两个10毫升的Polyprep柱。将24毫升悬浮的IgG树脂浆液或批次溶液倒入每个柱中，静置使其依靠重力沉降。

这相当于200 µL的压紧IgG树脂。如果沉降时间超过30分钟，则中间相可能已被脂质污染。沉降完成后，用四份连续的10 mL IgG D150缓冲液洗涤压紧的柱子。

为在柱上进行烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus，TEV）蛋白酶切割，封闭柱子底部，加入1毫升IgG D150缓冲液和100微升TEV蛋白酶。封闭柱子顶部，使用750 RPM转速、18摄氏度的温控混匀仪混合20分钟。重新悬浮树脂，并再次混合20分钟。

然后重新悬浮，并第三次重复20分钟的混合。将层析柱放回4摄氏度环境中，利用重力洗脱蛋白质复合物。随后，加入200 µL IgG D150以洗脱死体积。

根据文本方案制备钙调蛋白亲和树脂后，将钙调蛋白结合缓冲液和样品加入树脂中，并使用试管旋转仪在4 °C下孵育一小时。每100 µL钙调蛋白浆液准备一个2 mL聚丙烯柱，通过切去柱子末端以形成平坦开口。该方案详细说明了特定的缓冲液和停留体积的选择，旨在保持复合物的浓缩状态，并尽量减少其在树脂上的停留时间。

如果改变了培养液体积，建议相应调整重力柱中的树脂和缓冲液体积。使用不超过100微升的钙调蛋白浆液装柱，并通过重力作用，用5毫升钙调蛋白结合缓冲液洗涤树脂三次。每次使用200微升钙调蛋白洗脱缓冲液，共洗脱蛋白质三次。

然后，封闭层析柱底部，加入 20 µL 洗脱缓冲液，孵育 2.5 分钟，随后打开封闭端，使蛋白质在重力作用下洗脱。再次封闭层析柱底部，加入 200 µL 洗脱缓冲液，孵育 5 分钟。接着，打开层析柱底部，洗脱溶液。

第六次也是最后一次洗脱时，封闭柱子底部，用洗脱缓冲液孵育10分钟，然后打开封闭，进行洗脱。根据正文实验方案进行纯化后的分析，并储存样品。

如图所示，按照已发表的方案进行初步的TAP纯化后，该复合物在银染凝胶上呈现三条条带。经过多轮TAP方法优化，我们获得的复合物在天然凝胶上仅显示一条条带，表明其组装更为均一。与天然凝胶结果一致，使用针对TAP标签蛋白SNU-71的TAP抗体进行蛋白质印迹检测发现，按照已发表方案纯化的复合物中存在TAP标签蛋白的蛋白水解现象。

TAP 方法的改进显著减少了蛋白水解的程度，U1 snRNP 复合物中的 17 种蛋白质几乎全部通过 SDS-PAGE 分离，并通过多质谱技术被成功鉴定。负染电镜显示，在 TAP 方法的第一步和第二步纯化后，成功纯化的样品呈现出均一分散的颗粒；相比之下，当纯化失败时，则无法观察到正确大小的颗粒。

最终复合物的质量通过纯化后颗粒的菌苔进行评估，如图所示，负染电镜原始图像中颗粒呈单一分散状态。此外，颗粒的分类平均图像显示出清晰的结构特征，表明该样品可能适用于结构研究。熟练掌握后，该实验方案在解冻冻存的裂解细胞粉末后可在10至12小时内完成。

在遵循本方案时，必须确保所有溶液均不含蛋白酶和核酸酶，同时应快速操作，以防止复合物发生聚集或解离。观看本视频后，您应理解如何纯化出适合结构研究的高质量天然复合物，并掌握如何评估纯化是否成功。