用于磁性纳米颗粒免疫分析的阶梯式微流控丙烯酸装置的计算机数控微铣削

本方案描述了一种高分辨率的微铣削方法，用于制备丙烯酸微流控装置，以定量检测分析物浓度，其检测效果可与作为金标准的ELISA技术相媲美。该方法的亮点在于无需洁净室即可制备结构简单且成本低廉的热塑性微流控装置，能够实现较短的检测时间以及良好的定量检测限。首先进行表面研磨。

使用800微米的端铣刀切割出9 × 25毫米的矩形PMMA材料，厚度为1.3毫米。用双面胶带将其中一块矩形PMMA小心地固定在压电平台上。将Z传感器连接并放置在PMMA矩形片的表面。

选择检测针并将其移至传感器表面。手动降低检测针，但不要接触传感器。启动Z轴零点感应模式。

将200微米端铣刀以14,500转/分钟的转速旋转。缓慢将其下降至z轴原点坐标，然后将z轴原点重置为原点下方30微米处。

将此坐标设置为新的 Z 轴原点。在微铣削机软件中点击“切割”按钮，以激活切割面板。点击“添加”按钮，并选择包含先前创建的用于打磨丙烯酸表面代码的 TXT 文件。

单击输出按钮以启动该过程。对于五微米限位的铣削，首先将端铣刀的旋转速度设置为 11,000 rpm。然后，通过压电平台的接口将平台升高 6.5 微米。

将端铣刀沿 y 轴移动 500 微米。通过控制界面将压电平台在 z 轴上返回至初始值。接下来，从设计软件中打开先前创建的设计文件，进行微通道铣削。

单击打印按钮，进入属性菜单，然后单击与包含待加工设计图层相对应的颜色窗口。在工具面板中设置制造参数。对于孔的铣削，请切换至800微米的端铣刀。

通过点击相应的颜色窗口并选择对应的加工参数，激活直径为1.2毫米孔的设计层。在矩形对角的相反角落再加工两个孔，用于将亚克力板以倒置方式对齐并固定在新平台上。翻转亚克力板，并使用双面胶带将其粘贴在适配器上，确保加工出的柱体朝上。

使用设计软件打开与之前相对的另一面的孔位设计文件。用直径为1.5毫米、深度为0.7毫米的刀具铣削剩余一半的试剂入口和出口孔。用异丙醇清洗两块丙烯酸矩形片，并用蒸馏水冲洗。

将丙烯酸材料放入超声波清洗仪中浸泡10分钟。将两片丙烯酸板干燥后，用双面胶带固定在玻璃培养皿盖的内侧。然后将玻璃培养皿的底部放入一个更大的玻璃培养皿中。

向培养皿底部加入一毫升氯仿，并迅速盖上带有丙烯酸片的皿盖。立即将蒸馏水加入较大的培养皿底部，直至水位与培养皿盖齐平。让丙烯酸片暴露于氯仿气体中一分钟。

然后倾斜培养皿以打破水封，并立即打开培养皿。进行粘合时，将两块丙烯酸材料暴露过氯仿的面相对对齐，形成三明治结构。将丙烯酸材料放入压机中压合两个两分钟的周期，在此期间改变丙烯酸材料的对齐位置。

然后使用快干液体胶将两到三厘米长的软管连接到装置的每个孔上。用注射器将蒸馏水注入通道中。将装置浸入超声波清洗仪中处理10分钟。

然后排空装置通道内的水，并使用注射器注入5% BSA溶液。在5% BSA中制备直径为7.5微米的铁微粒悬浮液。将芯片和微粒悬浮液与封闭溶液在室温下孵育至少一小时。

接下来，使用注射器针头通过侧通道出口软管将微粒插入芯片中。将芯片垂直放置，然后分两步每次旋转90度，使微粒靶向并聚集在5微米的狭窄区域。用热封法密封丙烯酸装置的所有软管。

将进液管剪至仅剩几毫米。用洗涤缓冲液充满分配针头，并将其插入已剪断的软管中。让溶液滴出，然后将针头连接到设备上。

从侧通道切断出口软管，然后连接到注射泵。接着，对主通道的出口软管重复相同的步骤。然后将芯片固定到磁铁上。

进行免疫检测时，以每小时50微升的流速持续冲洗10分钟。使用微量移液器从分配针中移除残留的洗涤缓冲液，并加入50微升纳米颗粒悬浮液。以每小时100微升的流速使纳米颗粒悬浮液流动7分钟。

然后将流速调整为50微升每小时，并以相同流速继续流动15分钟。更换分配针，以相同流速加入洗涤缓冲液并流动10分钟。使用微量移液器吸除分配针中残留的洗涤缓冲液，加入100微升荧光底物。

调整底物输入、荧光检测和洗涤步骤的流速和时间参数。以每小时 50 微升的流速启动荧光原性底物的输入流，持续六分钟。在底物流停止前 15 秒，开启显微镜的荧光通道。

在底物停止前10秒，使用显微镜相机的软件开始图像采集，曝光时间为1,000毫秒。底物洗涤停止后，立即点击所需流速参数的“开始”按钮。以每秒一帧的速率持续成像六分钟。

在选定的测量流程停止后，立即点击洗涤流程的启动按钮。免疫测定中使用了溶菌酶偶联的纳米颗粒和辣根过氧化物酶偶联的二抗。通过比较捕获区域前后荧光强度的变化，观察到不同浓度一抗下的荧光强度增加，表明底物荧光的变化与一抗浓度呈直接正比关系。

在给定的一抗浓度下，荧光强度被绘制为不同荧光底物流速下随时间变化的函数。HRP酶对底物的转化能力与流速成反比，在流速为每小时一微升时获得最大荧光强度。针对不同一抗浓度下的各种流速，免疫反应前后荧光差异曲线显示，当一抗浓度为每毫升1,000纳克时，在所有评估的流速下荧光均达到饱和。

使用各流速下相对于一抗浓度所获得的荧光强度差值的最大值，绘制了标准曲线。在每小时一微升的流速下，荧光水平较高且变异性较大，表明该流速不利于反应底物的流动，并倾向于在捕获区域后发生积聚。由于微通道对氯仿暴露极为敏感且受温度影响显著，因此应特别注意微通道的密封步骤。

为了获得可重复的结果，温度必须始终保持一致。我们的系统有助于理解微粒的致密性和尺寸、纳米颗粒尺寸、抗原、检测抗体和底物如何共同决定基于纳米颗粒的微流控免疫分析的检测限。