跨物种序列比对预测易感性工具在蛋白质保守性快速评估中的应用演示

在化学品安全领域，SeqAPASS 协议提供了一种快速且简化的流程，用于评估蛋白质在多种物种间的保守性，从而推断毒性和生物学通路的相关知识。SeqAPASS 被开发为一种简化、透明且用户友好的基于网络的界面，旨在实现快速的跨物种外推，供研究人员和决策者共同使用。该工具利用现有物种敏感性信息，应对化学品毒性知识外推的挑战，能够一致地预测数百至数千种无法在实验室条件下进行测试的物种对化学品的易感性。

要开始使用 SeqAPASS 工具，请首先访问 seqapass.epa.gov。现有用户可选择登录按钮进入您的账户。新用户可通过选择主页上的链接创建账户。

登录 SeqAPASS 工具后，进入“请求 SeqAPASS 运行”选项卡。SeqAPASS 提供了多种有用资源，帮助用户确定查询的蛋白质靶标。这些资源可通过点击“确定蛋白质靶标”下方的下拉按钮进行访问。

确定蛋白质靶标后，点击“比较氨基酸序列”下的“按物种”或“按登录号”。例如，若要分析μ阿片受体的保守性，可点击“按登录号”，并在蛋白质登录号框中输入相应的登录号。除非用户已事先确定了蛋白质登录号，否则建议使用物种搜索选项。

选择“请求运行”以启动查询。提交查询后，选择页面顶部的“SeqAPASS 运行状态”标签，以查看已提交运行的状态。完成时间将取决于当前工具的使用情况。

在“查看 SeqAPASS 报告”标签页中，列出了在指定账户下执行的所有运行记录。选择“查看报告”可在网页浏览器中查看数据，点击“请求所选报告”可打开一级查询蛋白质信息页面，并查看结果及数据自定义选项。如需开展并运行二级 SeqAPASS 分析（用于评估特定蛋白质结构域的保守性），请在一级查询蛋白质信息页面中，点击“二级”标题旁的加号，以加载二级查询菜单。

单击“选择结构域”框，以列出查询蛋白的功能结构域。一旦从 NCBI 进化保守结构域数据库中识别出结构域，并在 SeqAPASS 下拉列表中选中该结构域，即可启动二级查询。操作方法是点击“请求结构域运行”按钮。

单击“刷新二级和三级运行”以填充二级数据。在“查看二级数据”下方，单击“选择已完成的结构域”框以选定已完成的结构域登录号。然后单击“查看二级数据”按钮以打开结果。

数据将显示在“查看 SeqAPASS”选项卡下所选层级的内容中。首先，我们查看第一层级的数据。在“查询蛋白信息”页面，选择主报告或完整报告旁边的单选按钮，以简洁或扩展格式查看数据。物种将显示为“是”或“否”的易感性预测结果，表明该蛋白相对于查询序列是否保守。

在报告中，点击相应的蛋白质登录号或物种 ID，可跳转至 NCBI 数据库以获取更多信息。如需查看具有易感性预测结果物种的相应毒性数据，请向右滚动结果表格，查看 ECOTOX 列。点击链接可在 ECOTOXicology 知识库中打开相应物种，以获取毒性数据。除完整报告和主报告外，还可通过选择“查看一级摘要报告”来浏览数据的摘要报告。

摘要报告会显示各个分类群的汇总指标和敏感性预测结果。任何格式的报告数据均可轻松下载。选择所需的报告类型后，点击“下载表格”即可将其保存为电子表格文件。

要查看二级数据，请滚动至“查看 SeqAPASS”标签页的顶部，然后选择“二级”。二级 SeqAPASS 数据的报告形式与一级数据类似，同时也在“查询蛋白质信息”页面底部提供。选择所需报告类型旁边的单选按钮即可查看相应数据。

二级报告展示的信息与一级报告类似，但增加了蛋白质结构域的相关信息。SeqAPASS 数据可轻松可视化，以方便解读。点击“可视化”旁边的加号，然后点击“可视化数据”按钮，即可在新标签页中打开交互式箱线图。

在新标签页中，选择箱线图（BoxPlot）按钮。在箱线图页面顶部，控制选项可帮助用户自定义图形。用户可从图中添加或移除分类群组，选择在图例中显示的物种，设置物种名称的显示方式，并高亮特定物种子集，例如受威胁或濒危物种。

可视化结果可轻松导出并保存。点击“下载箱形图”以选择文件类型并下载图像。在下载前，用户可自定义图像的文件类型和分辨率。

尽管默认的报告设置已能满足大多数分析需求，但可使用“查询蛋白质信息”菜单顶部的子菜单来更改参数。如需记录当前报告设置，可点击“下载当前报告设置”按钮，以下载包含当前应用设置的文件。此操作适用于一级和二级。

此处示例为一级分析。要启动三级 SeqAPASS 分析，请进入“一级查询蛋白质信息”页面，点击三级标题旁的加号，以展开三级查询菜单，该菜单支持单个氨基酸残基的比对。在进行三级分析之前，必须通过查阅现有文献来确定特定的氨基酸残基。

单击参考文献浏览器旁边的加号以打开参考文献浏览器工具。该工具可帮助您生成预定义的布尔检索式，用于查询现有文献。单击“生成 Google Scholar 链接”以生成文献检索字符串。

此内容可直接复制并用于检索目标文献数据库。或者，选择“搜索 Google 学术”将使用预定义的检索字符串自动在 Google 学术中进行文献搜索。选定氨基酸残基后，用户可设置三级分析。

选择用户选定物种将要比对和分析的模板序列。此外，可在“附加比对”框中输入其他模板序列。在比对特定序列之前，用户必须输入自定义的运行名称。

这将用于标识该次运行。在“选择分类群”框中选择分类群。需要注意的是，对于用户希望评估保护状况的所有分类群，此过程将重复进行。

选择所有需要与模板序列进行比对的物种后，点击“请求残基运行”。当所有物种比对完成后，点击“刷新二级和三级运行”，以在“选择三级运行名称”菜单中载入已完成的三级任务。三级数据可按单个分类群或多个分类群进行查看。

单击“合并三级数据”以打开合并的三级对话框，并同时分析多个分类群组。在“合并三级报告”对话框中，选择用作比较基准的三级模板，然后选择要比较的已完成任务。

按需排列三级任务顺序，然后点击“查看三级数据”以生成三级报告页面。在“三级模板蛋白质信息”页面中，将显示来自模板序列的先前已鉴定的氨基酸位置，并可选择用于比对。在文本框中输入以逗号分隔的位置，或从残基列表中进行选择。

输入所有位点后，选择“复制到残基列表”以将残基导入选择框中。确认所有氨基酸位点均已正确选择并核对无误后，点击“更新报告”以使用指定的位点更新比对序列。滚动至页面底部以查看结果报告。

与之前的级别相同，选择主报告或完整报告旁边的单选按钮以选定报告类型。三级报告会显示相似的物种和蛋白质，并包含所评估的每个氨基酸残基的比对和保守性信息。要保存报告，请点击报告底部的“下载表格”按钮，并将其保存为电子表格文件。

用户还可以选择“查看三级汇总报告”以查看并下载汇总报告表格。要查看三级数据的可视化结果，请点击可视化标题旁的加号，然后选择“可视化数据”以打开新页面。在可视化信息页面上，点击“热图”以打开交互式图形和控制选项。

在“可视化”页面的“控制”部分，选择要在热图中显示的分类群，使用箭头按钮进行移位，并可根据需要重新排序。默认情况下，热图可视化会显示物种的常见名称、总体易感性预测结果以及每个氨基酸残基的匹配状态。“控制”标题下的可展开菜单中提供了操作热图设置的选项。

在报告选项中，可选择生成简单报告或完整报告，并可在常见名称与科学名称之间切换所显示的物种。在可选选项下，可选择特定物种子集（如直系同源候选物种、受威胁物种、濒危物种以及常用模式生物），并在热图中对其进行高亮显示。在热图设置中，可通过取消或勾选复选框来自定义热图上显示的信息。

可以移除敏感性预测结果和敏感性文本，也可以移除氨基酸比对和氨基酸信息。要保存热图可视化结果，请点击“下载热图”并选择所需的文件类型。SeqAPASS 具备决策汇总报告功能，使用户能够同时快速评估不同层级和物种的敏感性预测结果。

从结果页面或数据可视化页面点击“将分析层级推送到DS报告”后，数据将被传输至DS报告标签页，在此处可整合并展示所有层级的分析结果。μ阿片受体的一级分析结果显示，易感性阈值为55%，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物以及大多数鱼类物种的相似性百分比均高于此阈值，因此其易感性预测结果为“是”。所有完全低于该阈值的物种，其易感性预测结果为“否”。

在二级分析中，μ阿片功能区的相似性阈值为88%，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物及大多数鱼类的相似性均高于此阈值，这为μ阿片受体在脊椎动物中的保守性提供了另一条证据。在三级分析中，所有被评估的物种均被预测为具有易感性。由于这些氨基酸在强效μ阿片受体激动剂和强效拮抗剂的结合中均具有重要作用，这些数据表明，靶向人类受体的阿片类化合物可能与脊椎动物各物种中的受体以类似方式相互作用。

SeqAPASS 的第三层级可用于假设生成。即使对于目标蛋白的关键氨基酸残基尚不明确，该工具仍可用于跨物种分析，识别序列中保守或保守性较低的区域。随后可利用分子生物学技术（如定点诱变研究）对这些假设进行验证。

SeqAPASS 最初的研究重点是化学靶标。然而，我们的研究正在扩展，以探索主要的代谢酶、转运蛋白以及参与生物富集的蛋白质。