利用三维体积视图图像检测与定量隧道纳米管

由于缺乏特异性的隧道纳米管标记物，该领域的研究进展受到限制，目前迫切需要一种能够识别、表征和定量隧道纳米管的方法。自动检测方法在缺乏开发算法或修改现有算法的专业知识的情况下难以实施，而我们的人工方法则更易于操作且具有更高的精确度。通过隧道纳米管实现的远距离细胞间物质转移，在多种疾病模型中均有体现，包括神经退行性疾病、病毒传播以及癌症。

因此，研究隧道纳米管及其在发病机制中的作用具有重要意义。在染色过程中，隧道纳米管可能会断裂。应避免使用盖玻片和载玻片封片，而改用玻璃底成像培养皿。

改良的固定方案有助于保持隧道纳米管的完整性。演示该实验操作的是来自Sangeeta NAF实验室的博士研究生Deepak KV。首先，在固定前用PBS将对照组和寡聚A-beta处理的细胞洗涤两次，每次两分钟。

使用2%甲醛固定液和2.5%戊二醛溶于pH 7.2的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中配制Karnovsky固定液。然后在成像培养皿中加入Karnovsky固定液，在室温下固定细胞45分钟。通过将0.1克皂苷溶解于5毫升胎牛血清（FBS）中，再加入95毫升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制孵育缓冲液。

然后用孵育缓冲液洗涤固定后的细胞，每次两分钟，共洗涤两次。固定后，在孵育缓冲液中按1:250的比例加入针对磷酸化PAK1的一抗，在4摄氏度的避光湿润孵育盒中孵育过夜。孵育24小时后的次日，用孵育缓冲液再次洗涤细胞两次，每次两分钟。

然后加入与 Alexa Fluor 488 和 Phalloidin 555 偶联的二抗。将细胞在室温下于避光湿润环境中孵育 1.5 小时。孵育结束后，用孵育缓冲液洗涤细胞两次，每次两分钟。

通过加入1:2000稀释的DAPI对细胞核进行染色，并在室温避光条件下孵育5至10分钟。使用25毫克DABCO溶于90%甘油和10% PBS中配制DABCO封片剂。为充分溶解，使用光谱纯级稀盐酸调节pH至8.6，并将溶液置于摇床上持续混匀。

作为抗淬灭剂，将DABCO封片剂直接加到成像培养皿中，该培养皿底部含有盖玻片。静置至少一至两小时后，直接进行共聚焦成像。为鉴定隧道纳米管，使用共聚焦激光扫描显微镜对免疫染色细胞采集Z轴层扫图像：首先在共聚焦软件的“track one”、“track two”和“track three”窗口中选择相应的通道，并依次点击所需的激光器。

在轨道一窗口下方点击 TPMT 选项，以荧光通道获取微分干涉差图像。选择软件中的采集选项卡，点击 Z 叠层选项卡，并等待窗口打开。然后点击实时扫描，以聚焦培养皿底部的细胞。

选择该聚焦图像作为第一个图像层，然后向上调焦至细胞最顶端，将该位置选为最后一个图像层。停止实时扫描，点击“Optimal”标签旁的数值，以确定图像层的步进大小，该设置将根据细胞厚度决定切片数量和间隔。使用405纳米、488纳米和561纳米激光，依次采集DAPI、FITC和TRITC三个通道的图像，像素驻留时间为1.02微秒。

使用荧光通道结合微分干涉差（DIC）通道拍摄图像，以观察细胞边界。在 Fiji 软件中打开以 czi 数据格式保存的共聚焦图像进行分析。选择“Hyperstack”选项以查看图像的每个 Z 层切片和通道。

滚动通道和Z轴堆栈滚动条，以选择特定通道的精确堆栈。然后通过滚动通道条，首先选择F-肌动蛋白染色通道，并手动滚动Z轴堆栈，逐个查看每一层。在Z轴堆栈的较低部分，寻找可见的、接近成像培养皿表面（Z值等于2）且似乎连接细胞的F-肌动蛋白染色结构，将其识别为神经突。

通过从 Z 等于 4 的位置向上滚动 Z 层切片，识别富含 F-肌动蛋白的悬浮细胞间通道，即隧道纳米管。在 Z 层切片靠近底部接近表面的区域寻找神经突起，并观察随着 Z 层切片向上滚动至 Z 等于 6 时，神经突起逐渐消失的现象。通过分析 Z 层切片中通道的悬浮特征，以类似识别 F-肌动蛋白阳性隧道纳米管的方法，识别磷酸化 PAK1 阳性的隧道纳米管。

由于磷酸化PAK1染色弱于F-actin染色，应在Z=4和Z=6处寻找磷酸化PAK1染色的膜纳米管结构。此外，观察DIC图像以确认F-actin和磷酸化PAK1染色的膜纳米管结构是细胞间的膜性通道。同时，合并F-actin与磷酸化PAK1通道，以验证所识别的膜纳米管为F-actin与磷酸化PAK1共染色的结构。

为了定量分析隧道纳米管，需手动计数总细胞数量以及已识别的隧道纳米管数量，并将结果以百分比形式表示。为了从Z轴层扫图像中区分出富含F-肌动蛋白和βIII微管蛋白阳性的、类似悬浮导管的隧道纳米管，应合并F-肌动蛋白与βIII微管蛋白的荧光通道，随后分析合并后图像的Z轴层扫数据。寻找仅由F-肌动蛋白染色的隧道纳米管，这类结构在Z=3时微弱可见，而在Z=6和Z=9时则明显清晰。

类似地，鉴定 F-actin 和 beta III 微管蛋白双阳性、在 Z=6 和 Z=9 处呈悬浮状的隧道纳米管样结构。从 Z 层切片的下部区域鉴定其他被 F-actin 和 beta III 微管蛋白染色的非悬浮突起结构。

使用 Fiji 中的线条工具测量隧道纳米管的直径。通过点击“分析”然后设置比例尺，以确保像素距离能从 czi 图像中自动设定，从而验证测量尺度的准确性。在 XY 平面上测量隧道纳米管的直径。

使用 Fiji 中的 Volume Viewer 插件（该插件支持三维重新切片及基于阈值的三维可视化），将 Z 轴层叠图像拆分为各个独立的通道。随后裁剪单通道的 Z 轴层叠图像，利用三维重建视图一次突出显示一条或两条隧道纳米管或神经突。在 XY 平面上固定一条隧道纳米管或神经突，并标记 XZ 和 YZ 轴的横截面。

在 XZ 和 YZ 平面上观察位于 XZ 平面底部的神经突，以及在上层 Z 层切片中的隧道纳米管。选择单个隧道纳米管或神经突，以重建 XZ 平面上的三维体积视图。在三维重建图像中，观察位于 Z 平面底部的神经突，以及呈悬空结构的隧道纳米管，这些隧道纳米管连接两个细胞但不接触底部的 Z 平面。

通过分析F-actin和磷酸化PAK1免疫染色细胞的共聚焦Z轴层扫图像，鉴定隧道纳米管。此外，分析微分干涉相差（DIC）图像以确认F-actin和磷酸化PAK1染色的隧道纳米管结构为细胞间的膜性通道。对细胞进行F-actin与β III微管蛋白的双重免疫染色，从而区分仅F-actin阳性的隧道纳米管与F-actin及β III微管蛋白双阳性的类隧道纳米管样膜性通道。

通过构建三维体积视图图像，可根据隧道状纳米管悬浮于两个细胞之间且不接触基质的特征，将其与其它神经突起的细胞突起区分开来。正确选择固定剂至关重要，因为样品固定不充分可能导致目标蛋白迅速发生蛋白水解降解，并降低特异性免疫反应性。