利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

本方案展示了对秀丽隐杆线虫进行机械破碎的方法，采用96孔板格式，可对单个线虫中的细菌载量进行中等通量的定量分析。与基于Pasel的方法相比，该技术提高了机械破碎的速度和均一性，使研究人员能够轻松获得高质量的单虫测量数据集。

该技术涉及多个动态步骤，容易遗漏操作环节。务必在开始前准备好所有材料、标记好的离心管、缓冲液和培养板。本次实验操作将由我实验室的研究专家负责人 Megan Taylor 进行示范。

首先，在微量离心管中用一毫升 M 九 TX 零一重新悬浮线虫样品。通过离心收集成虫，并弃去上清液。使用相同的离心参数。

用一毫升 M9TX01 缓冲液清洗线虫两次，再用一毫升 M9 线虫缓冲液清洗一次，以尽量减少外部细菌。然后，将每个样品重悬于含有两倍量热灭活 OP50 的一毫升 S 培养基中，置于培养管内。将培养管在 25°C 下孵育 20 至 30 分钟，以排出肠道中未黏附的细菌。

孵育后，用一毫升冰冷的M9TX01缓冲液将虫体清洗两次，并弃去上清液。将离心管置于冰上10分钟，使线虫麻痹。然后向每根离心管中加入一毫升含无香型漂白剂的冰冻M九线虫缓冲液。

将离心管置于冰上孵育至少10分钟，以杀死外部细菌。弃去次氯酸钠缓冲液，并将离心管放回冰上，防止线虫蠕动。随后，向每根离心管中加入1毫升冰冷的M9TX01，短暂离心5秒。

在微型离心机中离心。将离心管放回冰上，弃去上清液。重复此步骤一次。

用于线虫角质层的化学通透化。将含有线虫的试管（管中缓冲液体积为20微升）转移至室温下的试管架中。然后向每份温热的样品中加入100微升SDS/DTT溶液。

将试管在台面上孵育最多八分钟，以部分降解成虫的角质层。此时，线虫将死亡并沉降至试管底部。孵育结束后，小心弃去 SDS/DTT 上清液。

然后，向每根离心管中加入 1 毫升 M9TX01，短暂离心以沉淀线虫。弃去上清液，并将线虫重悬于 1 毫升含有 0.1% Triton X-100 的 M9 线虫缓冲液中。为进行线虫的机械破碎，准备一个无菌的 2 毫升深孔 96 孔板和一个硅胶板盖。

使用无菌药匙将少量无菌的36目碳化硅颗粒加入每个孔中，使颗粒恰好覆盖孔底。向每孔加入180 µL M9线虫缓冲液。标记列和行，然后用硅胶板盖轻轻覆盖酶标板。

接下来，将已透化的线虫转移至一个盛有M9TX01的小培养皿中，液体深度约为1厘米。在解剖显微镜下，用移液器吸取单个线虫，每份20微升，转移至96孔板的各个孔中。为排出可能粘附在移液器尖端的线虫，需从培养皿中无虫区域吸取20微升M9TX01，再将其释放回培养皿中。待所有线虫转移完毕后，用一张柔性的封板膜覆盖96孔板，确保有纸背衬的一面朝下，紧密贴合样品孔。

将硅胶封板垫轻轻放置在柔性封板膜上方，不要将盖子压入孔中。将板置于4°C环境中冷却30至60分钟，以防止在裂解过程中过热。冷却后，用力将硅胶封板垫压入各孔中以密封。

然后将培养板固定在组织破碎仪中。以30赫兹的频率振荡培养板1分钟。随后将培养板旋转180度，再次振荡1分钟。

将培养板在实验台面上用力敲击两到三次，以震落柔性封板膜上的任何颗粒。将整板在2,400 ×g条件下离心2分钟，使样品完全沉降至孔底。随后取下硅胶盖，撕去封板膜。

为制备线虫消化液的十倍系列稀释液，向96孔板的B至D行各孔中加入180微升1×PBS。使用设定为200微升的多通道移液器，通过反复吸打缓慢混匀线虫消化液。将尽可能多的液体转移至含有PBS的96孔板A行各孔中。

使用多通道移液器，从最上方一行吸取 20 微升液体，加入到 B 行中，随后进行混匀。重复此步骤，将 B 行液体转移至 C 行，再将 C 行液体转移至 D 行，以获得 1000 倍稀释液，用于单菌定植线虫的细菌定量。取各稀释液 10 至 20 微升，涂布于固体琼脂平板上。

对于多物种定植，将每种稀释液各取 100 微升接种于 10 厘米的琼脂平板上。采用本方案，在对冷麻痹的线虫进行表面漂白后，缓冲液中外部细菌数量减少，表明实现了有效的外部消毒，且未影响与肠道相关的细菌。

人工破碎线虫导致更高的异质性。无论是否使用Tri Andex，碳化硅颗粒均是破碎的理想选择。在96孔板方法中，大尺寸玻璃珠不适用于96孔板技术。

小玻璃珠产生的结果较为一致，但会堵塞尖端管道。在观察单一种类细菌和多物种细菌群落时，定植于相同细菌池中的线虫肠道载量表现出高度变异。定植了表达GFP细菌的线虫，在个体线虫的测量中显示出异质性。

对于表达GFP的这种细菌菌株，比较了野生型Bristol Len两型蠕虫与DAF两型IGF突变体的定植情况。结果显示，DAF 16突变体支持更多的细菌群体，而DAF两型对定植具有抗性。这种异质性在同一实验的不同重复中均表现出典型且一致的特征。

对数据进行重采样以模拟批次消化，结果发现与单条线虫数据相比，其分布发生了改变。通过批次外推得到的每条线虫CFU集中在个体数据的算术平均值附近，导致生物变异性的丢失。与其进行消化，不如使用经表面漂白和冲洗后的活线虫进行后续实验。

一旦将线虫从低温环境中移除，其运动将迅速恢复。