非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

本实验的总体目标是从恒河猴（Reus Maccas）肺脏中分离完整的器官生物基质，并将这些基质作为支架用于肺组织工程应用的研究。该目标通过以下步骤实现：首先使用去污剂、盐类和酶对恒河猴（Reus Maccas）的完整肺脏进行脱细胞处理；第二步是将脱细胞后的肺支架植入生物反应器中，该反应器能够同时对气道进行通气，并以液体细胞培养基灌注肺血管系统。

接下来，通过气道将干细胞接种到肺支架上，同时通过肺血管系统接种内皮细胞。最后一步是在生物反应器提供的通气和灌注条件下，在肺支架内培养细胞至所需时间，随后分析所形成的细胞和组织形态。最终，利用干细胞和内皮细胞对无细胞猕猴肺支架进行再细胞化，可获得具有天然肺组织解剖和组织学特征的工程化肺组织。

该方法有助于解答肺组织工程领域中的一些关键问题，例如干细胞或祖细胞是否能够单独或与成熟的肺上皮细胞和内皮细胞协同作用，用于再生肺组织。该技术的应用前景可延伸至终末期肺部疾病的治疗，因为利用患者来源的干细胞或祖细胞对去细胞肺基质进行再细胞化，有望增加可用于肺移植的供体肺数量。此外，利用患者自身干细胞构建的工程化肺组织可能具有抵抗免疫排斥的潜力。

我们最初产生这一方法的想法，源于观看了耶鲁大学Laura Nicholson博士实验室成员此前在JoVE上发表的一段视频。本文介绍了对该实验室原有啮齿类动物实验步骤的改进，以满足我们大型动物Resus Meac模型的需求。在处理猕猴组织时，必须格外小心，以防止发生感染暴露事件。

在处理非人灵长类动物组织之前，应穿戴个人防护装备，包括外科口罩、面罩、一层外科手套、一次性防护服，以及外层的第二层外科手套。将肺置于解剖盘中并保持平放，使用带有合适尺寸倒刺的雌性接头连接肺动脉。用经酒精消毒的塑料扎带将套管固定到位，并在气管周围套上一根塑料扎带。

将雌性诱捕连接器插入气管开口，并用扎带紧固在连接器的凸缘周围，以使气管固定在凸缘上。通过灌注含有每毫升30单位肝素和每毫升5微克硝普钠（sodium nitroprusside，简称SNP）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）来清除肺部滞留的空气，然后利用肺的自然回缩力将溶液排出，之后重复该操作。

在第三次气道安装 PBS 肝素 SNP 溶液后，再进行两次灌注。用堵头封闭气管插管。剪开心尖，用 PBS 肝素 SNP 冲洗心室内腔以去除残留血液，并切开两个心房，以便灌注时促进肺循环系统的引流。

将装有 PBS 肝素 SNP 溶液的 60 cc 注射器连接至肺动脉插管，小心拔出活塞，使液体流入血管系统。移除气管插管的堵塞物，利用气道的自然回缩力将气道内的液体排出。持续灌注，直至尽可能清除肺血管系统中的血液。

该操作中最困难的部分是有效地用液体冲洗和清洗肺部气道。由于气道原本并非用于输送液体，因此与气体相比，液体流动会受到限制，完成这些步骤需要耗费时间和耐心。我们建议继续执行方案，即使气道中仍有少量残留液体；随着脱细胞过程的推进以及细胞碎片被冲洗出来，液体黏度将保持较低水平，肺组织将能够高效地排出液体。第一天，将心肺组织块浸入去离子水中，使用连接在浸没状态下的气管和动脉套管上的60 mL注射器，对肺部进行充气并灌注去离子水。重复进行气道和血管的去离子水冲洗步骤。

再重复四次，总共进行五次洗涤，每次洗涤使用约0.5至1升水。五次洗涤后，将肺脏从水中取出，并将组织块浸入Triton溶液中。用Triton溶液充气并灌注肺脏。同前，再次重复灌注操作一次，并将浸没的器官在4摄氏度下于Triton溶液中过夜孵育。

经过过夜孵育后，将肺组织块从曲拉通溶液中取出，并用去离子水进行外部清洗。然后将组织块浸入新鲜的去离子水中。向气管和肺动脉内注入去离子水，重复冲洗五次，以彻底清除曲拉通溶液及细胞碎片。

将肺组织从去离子水中取出，浸入2%脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate，SDC）溶液中。以相同方式用SDC溶液进行充气和灌注。在第三天，将肺组织置于SDC溶液中，于4°C条件下孵育过夜。

用去离子水对外部组织以及气道和血管系统再冲洗五次。同前，将组织从去离子水中取出，浸入1摩尔氯化钠溶液中。同前，用氯化钠溶液进行膨胀和灌注，并在用五次去离子水冲洗肺部以清除氯化钠溶液后，将组织浸入氯化钠溶液中，在室温下孵育1小时。

同前，将肺组织浸入新鲜的DNA溶液中，并将该溶液注入气道和血管系统。在室温下用DNA溶液孵育肺组织1小时。随后将肺组织从DNA溶液中取出，并用PBS溶液进行外部清洗。

将肺组织浸入 PBS 溶液中，并通过气道和血管系统用该溶液冲洗五次。与之前相同，在第四天将肺组织置于密封容器中的 PBS 溶液内，于 4°C 下过夜保存。用新鲜的预冷 PBS 溶液通过气道和血管系统冲洗肺组织五次。

然后将它们置于无菌密封容器中的 PBS 溶液内，于 4 摄氏度保存，直至使用。在层流罩内根据示意图组装生物反应器组件。在文字版实验方案中，使用前立即用已在细胞培养孵箱的 5% CO2 环境中平衡过的培养基填充主腔室，将气管和血管插管适配器连接至肺插管。

通过将肺脏浸入培养基中，并将套管适配器连接至改装盖子上的相应接口，将器官安装至主生物反应器腔室。连接完成后，牢固且紧密地固定盖子。在反应持续期间，腔室将不再打开；使用注射器接口和装有18号针头的60 mL注射器，调节三通旋塞阀的流向，将管路中的空气抽出，使液体流入注射器。

将已安装器官且密封连续连接的生物反应器腔室转移至组织培养孵育箱中，以平衡温度和气体环境。通过连接至主腔室的注射泵对肺进行通气，大约每两分钟完成一次完整呼吸，同时通过蠕动泵以约10毫升/分钟的速度灌注血管系统，总时长30分钟，以实现气道定位。通过呼吸回路中三通旋塞阀连接的注射端口，缓慢注入细胞悬液，使肺膨胀。

将肺脏在37摄氏度、5% CO2条件下静态保持过夜，不进行气道或血管灌注，以允许细胞附着于去细胞化肺基质。过夜孵育后，重新启动标准气道通气程序，并对器官进行3至7天的培养以实现血管定植。通过旋转连接这两个腔室的管路中止流阀上的阀门，可将流动路径的方向从主腔室改变至内皮定植储液器；在接种内皮细胞时，使用蠕动泵逐步接种，同时利用磁力搅拌器轻轻搅拌；接种完成后停止搅拌。

停泵灌注并静置孵育约4至6小时。以主腔室培养基重新启动血管灌注，流速约为10毫升/分钟。在持续血管灌注的同时，与气道通气培养期同步，共同培养3至7天。

在脱细胞过程中，MCCA 肺逐渐变白，最终呈现半透明外观。然而，肺组织保持了其宏观解剖结构，仍具有较大的弹性，并能在液体充盈后产生自然回缩。在显微水平下。

脱细胞后，组织的组织学超微结构仍保持完整，即支气管、呼吸性细支气管、肺泡囊以及血管和毛细血管在低倍显微镜下仍可清晰分辨。

然而，组织学微细解剖结果显示，尽管脱细胞过程对肺的大体解剖结构和超微结构仅造成轻微影响，但组织中已完全缺乏完整的细胞，如图所示。脱细胞组织中仅残留微量DNA。此外，通过酒精沉淀浓缩并显示在0.8%琼脂糖凝胶中的微量DNA主要由低分子量的降解片段组成。

通过蛋白质印迹法分析天然肺组织和脱细胞肺组织中的蛋白质，评估细胞蛋白的去除效率。使用β-肌动蛋白抗体检测裂解液时，β-肌动蛋白在天然肺组织裂解液中可被明显检测到，而在脱细胞肺组织裂解液中则无法检测到，这表明在气道接种恒河猴骨髓来源的间充质干细胞（BMCs）并进行生物反应器培养约14天后，每两分钟经历一次吸气-呼气循环，细胞已被显著清除，且与细胞相关的蛋白质材料基本被去除。恒河猴脱细胞肺组织的实质部分已被有效脱细胞化。

BMC排列在肺泡隔上，同时保持肺泡腔清晰开放。利用生物反应器，BMC也定植于大气道的去细胞基质上；培养14天后，主支气管的管腔表面被一层类似扁平的BMC单层覆盖。此处所示的生物反应器中，是一个去细胞化的兔肺叶，在向血管系统接种微血管内皮细胞并以每分钟5毫升的流速持续灌注内皮细胞培养基五天后的情况。

组织学分析显示，肺实质中小血管壁内衬有细胞。在某些情况下，细胞似乎通过跨越管腔的多个细胞突起附着于基质；而在其他血管横切面中，可见细胞沿内皮表面排列，管腔清晰。按照本操作步骤进行。

还可以采用其他方法，如免疫组织化学、蛋白质印迹（Western blot）和定量实时 PCR，以回答进一步的问题，例如：接种的干细胞在脱细胞肺基质上或在生物反应器内与成熟的上皮细胞和内皮细胞共同培养后，是否分化为肺谱系细胞。观看本视频后，我们应能够充分掌握如何对非人灵长类动物的肺组织进行脱细胞处理，并将所得的脱细胞肺用作支架，在生物反应器系统中培养干细胞、上皮细胞和内皮细胞。请务必注意，操作非人灵长类动物组织可能具有极高危险性，因此在执行该操作时，必须采取充分的预防措施，例如穿戴完整的个人防护装备，包括面罩以及双层乳胶或丁腈手套。