利用单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序对视网膜基因表达与染色质可及性进行多重分析

该方案将实现利用单细胞RNA测序进行初步表型分析。当与单细胞ATAC测序联用时，可重建基因调控网络。采用MULTI-seq可降低初步研究的成本，而对配对样本进行固定以用于单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序，则允许对基因调控网络进行时间序列分析。

研究人员可利用本方案来理解控制发育和疾病进展的遗传网络。首先，向每个样本中加入20 µL的锚定条形码溶液，并用移液器吹打混匀。冰上孵育5分钟。

然后向每个样品中加入20 µL共锚定溶液，在冰上孵育5分钟。向每个样品中加入1 mL预冷的含1% BSA的PBS溶液，将细胞在4 °C下以300 × g离心5分钟。去除上清液时注意不要扰动细胞沉淀。

然后加入 400 µL 冰冷的含 1% BSA 的 PBS。在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟。使用血细胞计数板测定每个样本的细胞浓度，并计算 Gel Bead-in-Emulsion（GEM）所需的总细胞数和体积。

将各样本的计算体积合并至一个新的无菌1.5毫升离心管中，并测定合并样本的最终细胞浓度。在GEM生成和条形码标记后，通过大小选择进行基因表达cDNA的纯化，注意不要丢弃第一轮选择后的上清液，因其含有样本条形码。将上清液转移至一个新的无菌1.5毫升微量离心管中，并置于冰上保存。

涡旋磁性珠基片段大小选择试剂，向上清液中加入260 µL该试剂和180 µL 100%异丙醇。用移液器吹打混合10次，在室温下孵育5分钟。将离心管置于磁力架上，静置至溶液澄清。

待溶液澄清后，移除并弃去上清液。向珠中加入500微升80%乙醇，孵育30秒，然后弃去上清液。重复此步骤，共进行两次洗涤。

短暂离心磁珠，然后将其放回磁力架上。设置计时器为两分钟。随后用P10移液器去除残留的乙醇，并在磁力架上将磁珠晾干，持续剩余的两分钟。

将磁珠从磁力架上取下，加入100 µL洗脱缓冲液重悬。充分吹打混匀以重悬磁珠，在室温下孵育2分钟，然后将磁珠放回磁力架，静置至溶液澄清。将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。

按照演示的方法进行纯化，使用一半体积的洗脱缓冲液。对于将用于单细胞ATAC测序的样品，使用P200移液器吸除微量离心管中的任何液体，并用乙醇和干冰快速冷冻样品。对于将用于单细胞RNA测序的样品，按照文本稿件中的描述，使用木瓜蛋白酶进行细胞解离步骤。

在室温下以 300 × g 离心细胞 3 分钟，移去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。加入 1 毫升预冷的 PBS，吹打混匀 10 次，或直至细胞完全重悬。再次在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，并用 PBS 重复洗涤两次。

将离心管置于最低转速下开始涡旋，并逐滴加入900 µL预冷的甲醇，同时持续轻柔涡旋离心管，以防止细胞聚集。将细胞置于冰上孵育15分钟。使用血细胞计数板测定固定后细胞的浓度，并用台盼蓝评估固定步骤的有效性。

将冷冻组织和固定细胞储存在负80摄氏度。MULTI序列条形码技术可实现多个样本的联合测序及其后续的计算化解卷积。可根据每个细胞的条形码表达确定其来源样本。

这些合并的样本可作为单个数据集用于细胞聚类和细胞类型鉴定。由于每个细胞在GEM生成之前已被条形码标记，因此细胞双联体（doublets）极有可能表现出多个MULTI序列条形码的表达，从而可在聚类和细胞类型鉴定之前识别并去除大部分双联体。单细胞ATAC测序可用于生成包含细胞类型的数据库，以匹配单细胞RNA测序所发现的细胞类型。

单细胞RNA测序的基因表达数据与单细胞ATAC测序的DNA可及性信息相结合，能够实现基因调控网络的重建。在实施该实验方案时需注意，乙醇蒸发的两分钟时间控制对于后续洗脱步骤中的序列回收至关重要。利用配对的单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序重建基因调控网络，可为基因过表达和基因敲除研究提供潜在靶点。

MULTI-seq 可在此阶段用于鉴定细胞类型特异性效应。