药物递送系统与细胞相互作用的实验定量分析 体外：临床前纳米医学评价指南

本方案提供了关于载体系统如何与细胞相互作用的定量数据。定量数据对于工程化设计与优化至关重要。它使我们能够从“是或否”类的生物学问题，转向“程度如何”类的问题。

该技术有助于将药物载体在临床前的定性性能结果转化为定量结果。即使在与细胞表征系统不同的系统上对载体进行表征，该方法仍然适用。可能需要经过数次迭代，才能找到落在纳米检测线性或定量范围内的最佳载体稀释度。

寻找合适条件时请耐心操作。首先，将流动池安装到激光模块上。用一毫升蒸馏水以每秒0.1毫升的流速缓慢冲洗流动池。

如果流动池内形成气泡，应先将悬液部分回撤，使气泡与气液界面合并后再继续操作。然后将整个激光模块在仪器内固定锁紧。在冲洗过程进行到一半左右时启动相机。

务必确认载片上的碎屑已被冲洗干净。选择“捕获”以打开捕获设置选项卡，然后单击启动相机。用一毫升空气驱动系统。

若屏幕上可见任何静态载体，请根据制造商的说明清洗流动池。通过超声处理或涡旋振荡（取决于所用的载体系统）使载体充分悬浮，以制备用于纳米颗粒追踪分析的样品。将载体用水稀释，每种样品至少准备 0.6 至 1 毫升，载体浓度为每毫升 1×10⁷ 至 1×10⁹ 个载体。

取出激光模块并将其垂直放置。将第一份载体样品加入一个一毫升的注射器中，并将注射器连接到管路入口。然后小心地将样品注入流动池中。

如果流动池内形成气泡，应先将悬液部分回撤，使气泡与气液界面合并后再继续操作。确保整个流动池充满液体，然后暂停上样。如有需要，调节相机焦距以观察单个载体。

使用仪器右侧的旋转旋钮进行粗调焦。通过选择硬件选项卡，调节对焦滑块来进行更精细的调整。

为确保无过饱和现象，通过调节采集选项卡中的滑块来选择最佳相机水平。如果仪器配备此附件，将含有载样样本的注射器装入注射泵中。在标准操作程序（SOP）选项卡下，选择标准测量，进行五次采集，每次30秒。

输入基础文件名，如需要，可点击“高级”按钮，打开一个包含多种选项的模态对话框以添加额外的样品信息。点击“创建并运行脚本”，等待弹出提示框，要求推进样品。如果使用注射泵，请选择“硬件”标签，然后选择“注射泵”标签。

设定所需的输注速率，然后按“输注”键。如果不使用注射泵，则手动推进样品。在弹出窗口中，选择“确定”以开始采集。

每次完成五次捕获后，当“请进样”弹窗再次出现时，检查样本是否仍在流过流动池。然后选择“确定”以进行下一次捕获。在“过程”选项卡中，将检测阈值滑块调整至四到八之间，以准确识别屏幕上可见的独立载体。

可调整屏幕增益以辅助观察，此操作不会影响后续分析。在弹出窗口中，点击“确定”以启动追踪分析。通过在单次分析选项卡中点击分析项目，可监控分析进度。

分析完成后，等待导出设置提示出现。确认已选择包含 PDF 和实验摘要。根据需要选择其他导出格式。

在PDF数据导出结果部分，为确保所测浓度可靠，需验证实测的载体浓度是否在每毫升1×10⁷至1×10⁹个载体之间，并检查浓度测量结果下方是否存在任何错误提示或警告信息。从原液中选择不同稀释倍数重复实验两次或以上，确保每个样品的浓度均落在仪器的线性范围内。按照文本稿件中的描述计算原液载体浓度。

按照文稿中的描述配制游离或抗体偶联的荧光染料溶液。根据浓度、分子量和阿伏伽德罗常数，利用公式计算储备液的浓度。然后用载体稀释液对染料进行系列稀释，以制备标准曲线样品。

然后将载体样品加入测量板中，使用酶标仪检测荧光。按照文本稿件中的描述生成标准曲线。通过将总体荧光强度除以载体浓度，计算每个载体的绝对荧光强度。

通过确定相关通道中光电倍增管（PMT）的最佳电压设置，为最终的载体细胞实验配置流式细胞仪。运行阴性对照样本，即细胞未与载体共同孵育，以确定背景荧光水平。制备并重新悬浮流式细胞术定量微球。

使用与细胞样品相同的缓冲液。如果微球种群是分开提供的，需将其混合在一起。运行流式细胞术定量微球和载体细胞样品，以确定每个细胞的荧光强度。

运行流式细胞仪定量微球以生成标准曲线，将绝对荧光强度转换为平均荧光强度（MFI）。根据文本稿件中的描述，利用该标准曲线计算载体的理论 MFI。检测细胞载体样品，以确定每个样品每细胞的荧光强度。

最后，通过从样品的测量荧光值中减去背景荧光，再除以每个颗粒的荧光强度，计算出每个样品每细胞的载体数量。对于633纳米的聚甲基丙烯酸核壳颗粒，可直接利用流式细胞仪的流束测定其浓度及每个载体的荧光强度。相比之下，100纳米的超顺磁性氧化铁纳米颗粒过小，无法单独检测，因此采用整体流束进行分析。

在多个时间点使用标记的定量微球在流式细胞仪上生成标准曲线。检测到的MFI与定量微球的MESF值之间呈线性关系，且在不同检测日期之间结果总体相似。利用荧光标记的HeLa细胞进行时间进程实验，加入235纳米的聚甲基丙烯酸胶囊，时间为0至24小时，结果显示MFI随时间增加，表明胶囊与HeLa细胞发生了结合。

根据相对定量还是绝对定量，细胞对载体的表观响应差异显著。绝对定量不受标记强度的影响，因此更具可比性。这些技术是深入分析和比较颗粒性能的基础。

我们期待利用这些技术来确定数学模型的参数，从而能够在不依赖任何特定实验的情况下表征颗粒的性能。