单药与多药负载的物理包埋型聚合物胶束的制备与表征
2015年8月28日
本实验方案的目的是描述由两亲性嵌段共聚物组成的胶束药物递送系统中，对物理包埋的难溶性药物进行制备和表征的方法。
以下实验的总体目标是概述在疾病模型中评估载药微球之前，制备和表征载药微球的逐步流程。通过溶剂浇铸法制备微球，从而为研究提供可重复的微球样品。第二步是评估微球的载药稳定性及粒径，以确定微球负载并维持临床相关浓度药物的能力。
接下来，测定药物从My细胞中的释放速率，以确保在评估体内稳定性之前，My细胞具有适当的体外释放特性。结果表明，可重复制备的稳定My细胞能够基于本文所述的评估技术，为针对多种疾病状态的药物递送提供一个平台。与平衡载药或透析等现有方法相比，该技术的主要优势在于肌球蛋白的制备速度更快，且药物载量和粒径具有良好的可重复性。
该技术的意义在于为多种疾病状态的治疗或诊断提供了可能，因为纳米级药物相较于传统剂型具有更多优势。通常，刚开始接触这些技术的人可能会感到困难，尽管操作本身较为简单，但因为你还需要进行释放研究，否则无法准确评估突释效应。本次实验操作将由我的研究生Shaman Duke以及我的合作者Deepa进行演示。首先，称取一毫克DTX、一毫克EVR，以及15毫克Peg 4,000嵌段PLA 2200，用于制备双药载药胶束（DDM）。称量完成后，将药物与聚合物溶于0.5毫升乙腈中，然后将溶液转移至5毫升圆底烧瓶中，通过旋转蒸发仪在减压条件下蒸发除去乙腈-药物-聚合物溶液，从而形成一层均匀的药物分布聚合物薄膜。
随后，用 0.5 毫升预热至 50 摄氏度的去离子水重新水化药物聚合物膜，并将烧瓶置于 50 摄氏度水浴中轻轻振荡，以形成胶束。将所得溶液转移至离心管中，在 7,200 ×g 条件下离心 3 分钟。用针头吸取溶液，并通过 0.2 微米尼龙滤膜过滤胶束溶液至新的 1.5 毫升离心管中，以去除未溶解的药物或杂质。此时，采用 C8 色谱柱进行反相高效液相色谱（HPLC）分析，色谱柱在 40 摄氏度下以乙腈-水为流动相，在等度洗脱模式下平衡。分析前，将新制备的胶束溶液用乙腈按 1:100 的比例稀释，随后进行反相 HPLC 分析，以测定初始载药量。
在室温下保存未稀释的细胞 48 小时后，制备新鲜的稀释样品，通过反相高效液相色谱法重新评估，以确定药物在细胞中 48 小时内的稳定性。在 227 和 279 纳米波长下分别监测 DTX 和 DVR 的色谱峰，其保留时间分别为 1.7 和 5.7 分钟。以载药量的平均值 ± 标准差形式呈现数据。
接下来，将新制备的细胞与去离子水按1:20的比例稀释，使最终聚合物浓度为1.5毫克/毫升。将溶液转移至比浊管中，进行动态光散射测量。在173度方向测量氦氖激光的散射强度，以确定散射情况。
以平均 Z 平均粒径 ± 标准差表示数据，并同时提供粒径分布的多分散指数（PDI）。按照前述方法制备 DDM 后，将 2.5 毫升的菌体样品加入截留分子量为 7,000 克/摩尔的 3 毫升透析盒中。将透析盒置于 2.5 升 10 毫摩尔、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液中，按以下时间间隔进行操作。
吸取150微升溶液，并加入150微升新鲜缓冲液进行替换。每3小时更换一次缓冲液，以确保同步条件。采用反相高效液相色谱法分析样品，以确定药物浓度曲线。
使用统计软件 D-T-X-E-V-R，基于单相指数关联的简单扩散模型对药物释放数据进行拟合，结果显示在 PEG 2000 嵌段 PLA 1800 或 PEG 2000 嵌段 PLA 2200 中，DDM 在 48 小时内表现出相似的稳定性。所有我的细胞在室温下 48 小时后仍保留了初始载药量的 97% 或更高。根据动态光散射结果，所有我的细胞均呈现单峰分布，PDI 值均小于 0.2。
根据数据，DTX从单个髓样细胞和DDM中的释放量在48小时内约为60%。EVR从单个髓样细胞和DDM中的释放量分别为60%和50%。此处展示了从单个髓样细胞和DDM中达到50%药物释放所需的时间以及拟合优度数据。
除EVR个体外，我细胞的所有曲线拟合优度均高于0.950，这表明一级释放假设可较好地近似解释药物从我细胞及DDM中的释放行为。一旦掌握，这些技术可在数小时至数周内常规应用于大量药物与聚合物库，以我细胞为模型进行研究。在实施该操作时，重要的是务必在接触细胞培养或动物模型之前，对我细胞进行充分表征。此外，也可对其他递送系统（如脂质体递送系统）进行评估或表征，以探讨药物递送系统在治疗疗效中所起作用的相关问题。
观看本视频后，您应充分了解如何在疾病模型中评估载药细胞之前，对其进行制备与表征。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本方案概述了采用溶剂浇铸法制备和表征载药微球的方法。本研究强调了微球在多种疾病状态下用于有效药物递送的可重复性和稳定性。
关键研究组成部分
科学领域
- 药物递送系统
- 药学科学
- 生物技术
背景
- 药物溶解度是药物递送中的关键因素。
- 胶束系统可提高难溶性药物的溶解度。
- 对载药系统的表征对于评估其有效性至关重要。
- 药物载量的可重复性对于临床应用至关重要。
研究目的
- 制备并表征用于药物递送的载药细胞。
- 评估载药细胞的稳定性和粒径大小。
- 评价载药细胞的体外释放特性。
使用的方法
- 用于制备我的细胞的溶剂浇铸法。
- 评估我的细胞的载药稳定性及粒径。
- 测定我的细胞中药物的释放速率。
- 评价我的细胞在体内的稳定性。
主要结果
- 我的细胞可以稳定地被重复生成。
- 我的细胞表现出有效的药物装载和保留能力。
- 体外释放特性适合进一步研究。
- 与传统装载技术相比，该方法更快。
结论
- 可重复生成的我的细胞为药物递送提供了一个可行的平台。
- 该研究提出了一种制备载药我的细胞的可靠方法。
- 未来可利用该技术探索多种疾病状态的应用。
常见问题
行业重要性概述
该方案可实现聚合物胶束的可重复制备与表征，用于增溶疏水性药物，解决了早期制剂开发中的一个关键瓶颈问题。通过提供标准化的药物载药量、稳定性、粒径和释放动力学评估方法，该方案有助于提高临床前候选化合物筛选的可预测性。该方法可在投入昂贵的体内研究之前，降低制剂变异带来的风险，从而支持做出继续或终止项目的决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可实现对多西他赛和依维莫司等难溶于水的化合物进行制剂开发，用于靶点结合研究。
- 操作价值：溶剂浇铸法可快速、可重复地生成胶束，药物载量高达 DTX 1.86 mg/mL 和 EVR 1.85 mg/mL。
- 预测价值：药物高保留率（48小时>97%）有助于在后续药效学实验中实现可靠的给药。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：粒径小于 50 nm 且多分散系数（PDI）<0.2 的胶束可确保在高通量筛选中实现均一的药物递送。
- 操作价值：动态光散射技术可快速验证粒径，确保批间一致性。
- 检测适用性：在沉降条件（pH 7.4，37°C）下采用透析法进行释放行为表征，可获得用于构效关系（SAR）分析的定量扩散驱动释放数据。
转化与临床前研究
- 转化连续性：一级释放动力学（拟合优度 >0.95）可预测体内行为，支持剂量外推。
- 临床前风险降低：稳定性与释放特性表征可为药代动力学研究中的处方筛选提供依据。
- 疾病相关系统：该平台具有适应性，一旦胶束性能得到验证，即可用于多种疾病模型的筛选。
流程与工作流整合
该方法适用于从苗头化合物验证到先导化合物优化的发现连续过程，在此过程中，制剂技术可实现对难溶性化合物的生物学评价。
- 发现生物学：溶剂浇铸法可快速制备胶束，用于验证靶向假设，避免因制剂限制导致的假阴性结果。
- 筛选：标准化的粒径（<50 nm）和低多分散性有助于在基于细胞的检测中实现可重复的化合物递送。
- 分析：基于高效液相色谱（HPLC）的载药量和释放度测定，为制剂比较提供关键质量属性。
- 转化研究：可预测的释放曲线有助于在临床前模型中与药代动力学预期保持一致。
- 企业级复用：该方案不依赖特定聚合物或药物，可广泛应用于多个项目和治疗领域。
运营与企业影响
- 科学价值：通过扩散控制释放建模实现机制性风险降低，可提高对体内性能的预测能力。
- 操作价值：与平衡载药相比，溶剂浇铸法缩短了制备时间，提高了化合物库筛选的通量。
- 战略价值：可重复的载药量和粒径减小了与制剂相关的变异性，从而提升靶点验证中的数据质量。
- 项目组合影响：早期识别稳定且可释放的制剂有助于基于风险评估推进候选药物的开发。
实施注意事项
- 需要具备高分子化学、溶剂操作和高效液相色谱分析方面的专业知识。
- 需要使用旋转蒸发仪、离心机、动态光散射仪和透析装置。
- 不同团队间实现标准化需要保持一致的溶剂浇铸参数和水合温度（50°C）。
- 若将该方法应用于其他聚合物或药物，需重新优化溶剂比例和薄膜厚度。
- 实际局限性：该方法假设药物在乙腈中稳定，未考虑溶剂蒸发过程中可能发生的降解。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:42
Preparation of Individual and Multi-drug Loaded Micelles by Solvent Casting Method
2:56
Assessment of Drug Loading and Stability in Micelles Using Reverse-phase High Performance Liquid Chromatography
3:52
Assessment of Micelle Particle Size by Dynamic Light Scattering
4:29
Assessment of In Vitro Drug Release from Individual Micelles and Dual Drug Micelles
5:21
Results: Preparation and Characterization of Poorly Water Soluble Drugs in Micelles
6:29
Conclusion
