利用DNA荧光增强型适体作为信号报告分子的分裂杂交探针用于序列特异性核酸分析

我们正在开发用于序列特异性核酸分析的新型荧光杂交探针。最近，杂交分析工具已得到扩展，出现了利用CRISPR-Cas系统的检测方法。目前，最先进的杂交探针（如TaqMan探针和分子信标探针）被广泛用于核酸靶标的分析。

单核苷酸替换和核酸靶标的准确检测在实际操作中仍然具有挑战性。我们的实验方案在确保所需细胞活性的同时，提供了一种无标记的荧光信号读出方法。首先，设计构成SLAS的两条未经修饰的DNA寡核苷酸链的序列。

使用包含 DAP-10-42 第 6 至 39 位核苷酸的片段。通过移除第 5 位突出的胸腺嘧啶，将由第 1 至 8 位和第 36 至 42 位核苷酸组成的茎环 1 改变为茎环 1'，使茎环缩短为四个碱基对，并添加末端的胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对。将第 9 至 29 位核苷酸包含在一条 SLAS 链中，第 30 至 35 位核苷酸包含在另一条链中。

通过添加脱氧 GGTCAT，将片段的 3' 末端序列从第 9 至 29 位核苷酸进行延伸。然后，通过添加脱氧 TGACC，延伸第 30 至 35 位片段的 5' 末端序列，形成一个六碱基对的茎环结构 2。接着，在两条链上均使用脱氧 TT 连接子延伸茎环结构 1，并添加与核酸靶标互补的 DNA 序列。

由此可获得构成探针的SLAS-U和SLAS-S链的序列。SLAS-S应与包含单核苷酸替换位点的7至10个核苷酸区域互补。

然后确保 SLAS-U 的靶向结合臂与 SLAS-S 区域邻近的 15 至 25 个核苷酸片段互补。使用 UNAFold 网络服务器评估靶向结合双链的熔解温度。点击 INAMelt 标签页。

前往“应用程序”并选择“双态熔解杂交”。在左侧和右侧的输入框中，按5'到3'方向输入相互作用的序列。然后将检测温度调整为22摄氏度，并将一价和二价阳离子浓度分别设置为20毫摩尔和25毫摩尔。

在相应的输入框中调整相互作用序列的浓度。点击提交后，查看相应双链的吉布斯自由能变化、焓、熵以及熔解温度值。确认完全匹配的目标序列以及SLAS-S和SLAS-U的目标结合臂的熔解温度高于检测温度（22摄氏度）。

确保SLAS-S与错配靶标之间的双链体产生的熔解温度低于检测温度，以维持特异性。如有必要，可调整靶标结合臂的长度以满足这些条件。从商业DNA供应商处获取最终的SLAS-U和SLAS-S寡核苷酸链，或使用自动化DNA合成仪在实验室内部合成。

配制 Auramine O、SLAS-S、SLAS-U 和检测缓冲液的储备溶液。制备包含所有检测组分但不含靶标的主混合液。向主混合液的最终体积的五分之六中加入无核酸酶水。

然后涡旋并离心混合液。将50 µL分装至每个样品管中。接下来，将一个样品标记为无靶标空白对照，另一个标记为阳性对照。

取10微升含有目标物的样本加入到含有预混液的离心管中，制成60微升的反应体系。对于空白对照，加入10微升无核酸酶水。然后，用移液器将10微升含有目标序列的合成DNA寡核苷酸加入阳性对照管中。

使用微型离心机将所有样品在离心机中短暂离心混匀。然后在22°C条件下孵育试管10至60分钟。使用荧光分光光度计，在475纳米激发光下测定540纳米处的荧光强度。

SLAS 被设计用于靶向 NANOGP8 基因的特定片段。靶标 M 与 SLAS-S 链完全互补，而靶标 MM 在第 1,423 位为胞嘧啶核苷酸，与 SLAS-S 形成错配。加入完全互补的靶标 M 后，荧光信号持续上升，并在 45 至 50 分钟后达到平台期。

然而，在10分钟内即可检测到清晰的信号，信噪比达到10。SLAS对完全匹配的目标显示出强烈的荧光信号，而对错配目标或空白样本则无显著信号。荧光信号强度在目标物浓度达到500纳摩尔（nanomolar）时呈线性增长，从而实现了定量分析及检测限的确定。PCR扩增样本显示出不同程度的信号，其中仅有样本2的荧光信号超过2的阈值。

根据标准曲线，样品2中NANOGP8扩增子的浓度估计为124±13 纳摩尔。SLAS信号的荧光检测结果在台式分光光度计和便携式荧光计上均保持一致。使用紫外光照射时，亦可肉眼观察到信号与空白的比值超过20。