人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

本方案描述了心肌类球体的生成、维持及光学分析的工作流程。这些心肌类球体对于弥补现有体外疾病模型的不足至关重要。该技术可使研究人员实现下一代高通量筛选及心肌类球体的功能性保存。

首先，向含有融合生长的人诱导多能干细胞来源心肌细胞的培养板的每个孔中加入每平方厘米1毫升的无菌心肌细胞分离液。在37摄氏度下孵育15分钟。在明场显微镜4倍放大下观察呈白色且呈圆形的细胞，以确认细胞已脱离。

使用5毫升移液管，用2毫升预热的基础培养基反复吹打细胞，进行机械解离，以制备单细胞悬液。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在300×g条件下离心3分钟。然后吸除上清液，将细胞重悬于1毫升hiPSC-CM重铺培养基中。

使用1,000微升移液枪头重悬细胞沉淀。反复吹打三到四次，直至溶液呈均匀状态，然后将细胞悬液转移至计数板中进行细胞计数，并将适量细胞加入100微升传代培养基中，分别接种至超低吸附、圆底的96孔板的各个孔内。将含有心肌球体的培养板置于培养箱中的轨道摇床上，于37摄氏度、5%二氧化碳、21%氧气和90%湿度条件下，以70 rpm振荡培养24小时。

为避免类球体破裂，每次仅从每个孔中吸出50微升培养基，并在最初48小时内每孔加入100微升RPMI加B27培养基。随后，从每个孔中吸出100微升培养基，并每孔加入100微升成熟培养基。将细胞维持在成熟培养基中，并每两到三天更换一次培养基。

将球状体培养板置于冰上预冷10分钟，然后以70g离心3分钟。吸除培养基，每孔保留50微升。随后每孔加入200微升冰上预冷的hiPSC冻存液。

使用封板膜将板密封。制备硅胶模具时，按10:1的比例混合硅胶弹性体试剂盒的组分，并将混合液加入到孔板的底部。使用真空泵脱气15至20分钟。

将模具放入烘箱中，在 60 摄氏度下固化 8 小时，得到半柔性弹性体，并从平板上剥离。小心地将密封的平板放入硅胶模具中，确保孔板与冷冻设备之间有均匀的热交换。在制备好的硅胶模具中，于 -80 摄氏度下冷冻平板至少 4 小时，然后将平板转移至液氮罐或 -150 摄氏度的超低温冰箱中进行长期保存。

为确保心肌类球体快速解冻，每次从液氮中取出一块含有心肌类球体的细胞板，放入37摄氏度、含5%二氧化碳、21%氧气和90%湿度的培养箱中孵育15分钟。移除板上的密封膜，每孔吸除150微升液体，然后向每孔加入200微升预热的基础培养基。以70×g离心3分钟，并重复一次预热基础培养基洗涤步骤。

操作完成后，吸除每孔中的 150 微升培养基，并向每孔中加入 200 微升心肌细胞解冻培养基。随后重复心肌球体生成过程中所述的 RPMI 洗涤步骤，接着将细胞维持在成熟培养基中。培养一周后，解冻的心肌球体即可用于钙处理的光学成像。

吸出每孔150微升培养基。在避光条件下，每孔加入100微升Cal-520 AM钙染料培养基处理解冻的心脏类球体，并将培养板孵育60分钟。启动显微镜并确保环境控制功能已开启，以准备钙信号采集与分析系统。

调整相机和框架光圈尺寸，以尽量减少背景区域。为测量钙信号，使用488纳米激光，将对比度设置为黑色背景，钙释放时呈现明亮的绿色信号。录制一段视频，要求在10秒内持续记录2到10个峰。

录制一段10秒的视频，以锯齿状方式扫描整个96孔板，初始向左移动，然后向下移动，以覆盖整块孔板。采集钙瞬变信号后，使用荧光轨迹分析软件分析数据。心肌类球体在接种后第一天即形成三维结构，可培养长达六周。

大多数三周大的心肌类球体表现出规则的肌节结构，α-辅肌动蛋白和肌钙蛋白T表达明显。在培养过程中，第0天和三周大的心肌类球体中均检测到高水平的α-辅肌动蛋白，表明细胞组成稳定且纯度高。与在二维条件下培养90天的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）相比，类球体中心脏基因、桥粒蛋白和线粒体的表达水平更高。心肌类球体在生成后的前三周搏动比例相似，但在第六周显著下降，这是由于心肌类球体发生退化所致。

与对照组相比，搏动频率在第3周显著降低，并在第6周因功能退化而进一步下降。钙瞬变参数显示，第2周的峰值更高，而第3周的上升时间、衰减时间以及90%衰减时的钙瞬变持续时间均显著延长，表明由hiPSC-CM衍生的球状体在生成后第2周和第3周功能状态最佳。球状体的尺寸随接种细胞数量的增加而增大。

在体积更大、更成熟的类球体中，搏动频率显著更高。与2.5k类球体相比，5k、10k和20k类球体均表现出相似且显著更高的搏动率。冷冻保存对心肌类球体内的细胞活力无影响。

解冻后的心肌类球体与新鲜的同龄类球体在肌节蛋白表达上相似，表明冷冻保存效果良好。解冻后与新鲜的心脏类球体在搏动频率上无显著差异。在上升时间、下降时间以及解冻后或新鲜CS的CTD90方面均未观察到显著变化。除了可用于疾病建模和高通量药物筛选外，这些类球体还可用于作为细胞外囊泡生产的生物反应器以及细胞外囊泡相关疗法。

此外，这些球状体的生物样本库可作为再生策略中心肌细胞供应的新途径。越来越多的证据表明，来源于患者的囊性纤维化、癌症和心脏球状体干细胞模型的生物样本库，在揭示药物筛选的分子机制以及实现个体化医疗方面具有巨大潜力。