用于增强基因递送的间充质干细胞膜包被纳米囊泡的开发

在本实验方案中，我们介绍了一种制备间充质干细胞来源纳米囊泡的方法，该纳米囊泡类似于细胞外囊泡，并可包封腺相关病毒（AAV），从而提高基因递送效率。我们将这种含有AAV的纳米囊泡称为CME-AAV。与新兴的基因递送载体EV-AAV相比，CME-AAV在细胞来源方面具有更高的灵活性，且产量更高。

首先，从培养皿中移除处于70%至90%融合度的人类间充质干细胞的培养基。使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，并转移至含有PBS的锥形管中。在4°C条件下，以300g离心5分钟，使细胞沉淀。

然后用 PBS 洗涤细胞沉淀两次，并再次离心。将最终的细胞沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂混合物的 PBS 中。随后将细胞悬液进行三次冻融循环，以破坏细胞膜并制备粗裂解液。

使用移液器充分匀浆裂解液。然后在4°C条件下以1,000g离心20分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新管中。

在4°C条件下，以18,000g离心一小时，使膜组分沉淀。弃去上清液，并将膜沉淀物重悬于PBS中，以获得粗制的间充质干细胞膜组分。随后，将膜悬液依次通过装有20至27号针头的注射器，进行匀浆处理。

使用二辛可宁酸法测定匀浆化膜悬液的蛋白浓度。将悬液分装后于-80摄氏度保存，直至使用。每次冻融循环后，使用27号针头注射器重新匀浆悬液。

将制备好的膜悬液与腺相关病毒（AAV）按每 1×10¹⁰ 基因组拷贝加入 150 微克蛋白的比例混合。在 37°C 下轻轻振荡孵育 30 分钟。将膜与病毒的混合物加入装有 400 纳米聚碳酸酯膜的小型挤出器中。

将混合物通过挤出机挤出20次，以促进包封。将400纳米膜更换为200纳米膜，并重复挤出过程。收集含有包封病毒的处理后悬液，以及未包封的病毒和空囊泡。

如有需要，可合并多个批次，并立即进行纯化。使用10倍浓度的磷酸盐缓冲液（10x PBS）和无菌去离子水稀释储备的碘克沙醇溶液，配制40%和25%的溶液。用移液器将1毫升40%碘克沙醇溶液加入13.2毫升开口薄壁超清离心管底部。

然后，在40% 碘克沙醇层上方覆盖3 mL的25%碘克沙醇，形成不连续梯度。轻柔地将7 mL处理后的悬液覆盖于梯度顶部。平衡离心管并将其装入水平转子超速离心机中。

在4°C条件下，以150,000g离心3小时，使用快速加速和慢速减速模式。然后小心取出离心管，避免扰动密度梯度。从上到下收集每1毫升的组分，分别置于已标记的1.5毫升微量离心管中。

将所有组分置于冰上。随后，鉴定并合并含有纯化后的CME-AAVs的第七和第八组分，收集到一个新的开口超速离心管中。用PBS补足体积至11毫升。

然后，用1 mL移液器轻轻混匀。采用快速加速和减速，将合并的组分在4 °C条件下于150,000 ×g离心3小时。小心弃去上清液。

根据所需的浓度，将沉淀重悬于50至200微升无菌PBS中。分装纯化的样品，于-80摄氏度保存，以备后续使用。

用无菌 PBS 配制包封病毒和对照病毒的工作液。将等量基因组拷贝的包封病毒或对照病毒直接加入每孔的培养基中。设置阴性对照孔，加入等体积的 PBS 或空病毒颗粒。

轻轻摇晃培养板以确保均匀分布，并根据实验设计孵育24至72小时。随后，轻轻吸除培养基。用PBS清洗细胞两次，注意不要使细胞脱落。

根据制造商说明书，使用 Hoechst 33342 对细胞核进行染色。使用配备增强型绿色荧光蛋白和 Hoechst 适当滤光片组的倒置荧光显微镜进行活细胞荧光成像。定量分析时选择 10x 或 20x 物镜，如需高分辨率成像，则选用 63x 物镜。

每个孔至少采集五个视野，使用相同的成像参数。将所有图像以原始格式和灰度格式保存，用于定量分析。透射电子显微镜显示，CME-AAV 的大小尺寸和膜结合结构与细胞外囊泡相似。

通过Western blot分析，在CME-AAV中检测到间充质干细胞膜标志物CD73和CD90。通过SDS-PAGE鉴定出CME-AAV中的三种主要腺相关病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。NanoSight分析显示CME-AAV9。

EGFP的平均直径为128.6纳米，总颗粒浓度为每毫升1.32×10¹⁰个颗粒。荧光显微镜结果显示，CME-AAV9.EGFP在HEK293T细胞中产生的增强型绿色荧光蛋白表达水平显著更高。

具有膜包被的病毒实现了约2.5倍更高的基因表达，表明其细胞摄取能力增强，并可能改善了细胞内转运。活体生物发光成像显示，经CME-AAV给药后，肝脏表现出最强的发光信号。对肝脏区域的定量分析表明，CME-AAV给药可显著提高基因表达水平。

这些方案描述了通过挤出法和密度梯度超速离心获得纯化的细胞膜包被腺相关病毒（CME-AAV）的步骤。其中有两个关键因素需要仔细考虑：挤出前的细胞碎片预处理，以及优化细胞膜片段与AAV的混合比例，以控制CME-AAV的颗粒数与基因组数之比。未来的研究可进一步探索细胞膜包封技术，以增强免疫保护作用和功能化表面特性，从而将CME-AAV优化为一种多功能的AAV递送平台。