一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

这是一种监测R-pass细胞核的细胞表型和特征的简单方法。该方法也可常用于全基因组研究，以发现影响R-pass细胞核稳定性的遗传因素。由于这是一种已建立良好的模式生物，与使用人类细胞系或动物模型相比，该技术操作简便，且不需要耗费过多时间和精力。

R-pass 核的聚集与帕金森病密切相关。可利用该人源化酵母模型检测可能影响 R-pass 核稳定性的蛋白质或化学物质。首先，在 SD-URA 琼脂平板上点种三个单菌落，以筛选含有 α-突触核蛋白质粒的细胞。

然后，将每种菌株的三区划酵母转化子接种至3毫升SRD-URA培养基中，该培养基含有2%棉子糖和0.1%葡萄糖，用于选择性培养含有质粒的酵母，并通过Gal1启动子抑制α-突触核蛋白的诱导表达。将接种后的培养物在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养。次日，将过夜培养的细胞接种至3毫升新鲜SRD-URA培养基中，直至其在600纳米处的光密度达到0.2。

然后，在30摄氏度下，以每分钟200转的振荡速度培养6小时。使用分光光度计在600纳米处测定光密度。接着，在96孔板的第1列中，用无菌蒸馏水将样品稀释至600纳米处的光密度为0.5，以使各培养物中的细胞数量相等。

通过向接下来的五个孔中各加入160微升无菌蒸馏水，对酵母细胞进行5倍梯度稀释，并在每孔中逐孔稀释细胞时确保总体积为40微升。使用多通道移液器从每个孔中转移10微升，将样品点样至SD-URA琼脂平板用于对照，以及SG-URA琼脂平板用于监测毒性。将点样后的平板倒置于30摄氏度培养四天。

每隔24小时拍摄一次平板图像，直至第四天，然后通过肉眼比较点种菌株的生长差异来分析数据。将每种菌株的三个酵母转化子接种到3毫升SRD-URA培养基中，在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下过夜培养。次日，测定过夜培养细胞在600纳米处的光密度，并将细胞接种至96孔板中，总体积为200微升的新鲜SD-URA和SG-URA培养基。

将包括细胞在内的终体积调整至200微升，并将初始细胞光密度在600纳米处调至0.05。调整微量滴定板中的程序设置：设定目标温度为30摄氏度，间隔时间为15分钟，振荡持续时间为890秒，振荡振幅为5毫米，检测项目为600纳米处的吸光度。

将平板置于酶标仪中孵育 2-3 天，使所有菌株均达到稳定期。通过绘制生长曲线分析数据。将酵母转化子接种至 3 毫升 SRD-URA 培养基中，在 30 摄氏度、200 转/分钟振荡条件下过夜培养。

第二天，将过夜培养的细胞重新接种至3毫升新鲜SRD-URA培养基中，调整600纳米处的光密度至0.003，然后在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养，直至光密度达到0.2。随后加入300微升20%半乳糖，并在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下继续培养6小时。取1毫升菌液，以800 ×g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。

用30微升蒸馏水轻轻重悬细胞沉淀。在玻璃载玻片上制备琼脂糖凝胶垫。重悬细胞后，取5微升细胞悬液加到玻璃载玻片上，用剪切好的琼脂糖垫覆盖细胞，以供观察。

使用100倍物镜进行显微成像时，利用程序中的屏幕截图功能生成图像，并选择明场模式，使用浸油配合100倍物镜对细胞进行聚焦。切换至GFP荧光滤光片，并将图像曝光时间调整至50毫秒至300毫秒之间，以平衡信噪比，获得清晰图像。打开图像文件，使用图像分析软件根据细胞内焦点数量对细胞进行计数，以分析数据。

在含有半乳糖作为诱导剂的琼脂平板上，PRS426 载体中 Gal1 启动子驱动的突触核蛋白表达显示出显著的生长迟滞。在液体培养中也观察到突触核蛋白表达引起的生长差异。在两种培养条件下，野生型突触核蛋白以及携带 E46K 或 A53T 突变的变体均表现出由突触核蛋白毒性导致的生长缺陷。

然而，α-突触核蛋白A30P突变体不会形成聚集体，表现出非毒性表型。表现出严重细胞毒性的菌株中可见α-突触核蛋白聚集体的焦点，而在A30P突变体中，毒性较低的α-突触核蛋白在细胞内呈弥散分布。为了获得可重复的结果，在每次实验中使用处于相同生长阶段的细胞非常重要，尤其是在监测α-突触核蛋白相关表型时。

如我们在荧光显微镜数据中所示，α-突触核蛋白可形成较大的聚集体。因此，可通过离心法对其进行简单分级分离，并使用特异性针对α-突触核蛋白的抗体通过蛋白质印迹法进行定量。该技术适用于高通量筛选，可用于发现影响α-突触核蛋白聚集的新遗传因素和化学化合物。

因此，我们希望能够找到帕金森病新的治疗候选药物。