表征酵母神经退行性蛋白病模型中的组蛋白翻译后修饰变化

本方案使我们能够便捷地探究神经退行性疾病的表观遗传特征。该技术的主要优势在于利用酵母作为模型系统，与其他细胞和动物神经退行性疾病模型相比，酵母具有快速高效且成本低廉的特点。该技术使我们能够绘制出神经退行性疾病中出现的表观遗传变化，这可能为疾病诊断提供新的标志物，并为治疗提供新的靶点。

该方法可用于进一步研究表观遗传标记在神经退行性疾病中的作用，并可经修改后用于评估人类成纤维细胞和诱导性多能干细胞。此特定方法包含多个需要通过视觉演示才能准确展示的细节，例如蛋白质印迹装置的正确上样操作。本次实验操作将由 Michel Fallah 和 Navin Rana 进行演示，两人均为 Torrente 实验室的本科研究人员。

首先将酵母从冷冻甘油菌种中重新划线接种至含2%葡萄糖的组氨酸选择性琼脂培养基平板上，在30摄氏度条件下培养两到三天。培养结束后，将每种过表达模型及对照菌株的重新划线酵母分别接种至5毫升组氨酸选择性液体培养基中，添加2%棉子糖，在30摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养。

第二天早晨，在选择性培养基中加入2%半乳糖，每种过表达模型和对照组分别培养100毫升液体培养物过夜。测定600纳米处的光密度（OD600），以确定为使过表达培养物的起始OD600达到0.3所需的过夜培养物体积。为诱导蛋白过表达，将酵母在30摄氏度下于半乳糖培养基中振荡培养，持续适当的实验时间。

然后在诱导期结束时测定每种培养物的OD600值，并将所有细胞数量标准化至最低的OD600值。将培养物在50毫升离心管中通过离心收集，并将沉淀物重新悬浮于每10毫升培养物体积对应1毫升的无菌蒸馏水中。

将细胞重悬液每管1毫升分装至若干微量离心管中，进行额外一次离心，并吸除上清液。随后将细胞沉淀在液氮中速冻，于-80摄氏度保存。为进行蛋白质印迹分析而裂解细胞时，先将酵母细胞沉淀置于冰上解冻，再重悬于100微升蒸馏水中。

向每个细胞样品中加入 300 微升 0.2 摩尔的氢氧化钠和 20 微升 2-巯基乙醇。用移液器重悬沉淀。冰上孵育 10 分钟后，通过离心收集细胞沉淀，并将样品重悬于 100 微升上样染料中。

然后将样品在加热块上煮沸10分钟。在样品裂解的同时，将两块凝胶放入凝胶架中，并将电泳缓冲液加至内槽顶部，外槽加至双凝胶线标记处。当样品准备好后，向每块10孔、12%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入15 µL细胞裂解液，并在蛋白ladder加样孔中加入5 µL蛋白ladder。

在150伏电压下电泳约45分钟，或直至加样染料前沿迁移至凝胶底部。在电泳进行的同时，每块凝胶用转移缓冲液浸泡两块纤维垫，并用甲醇浸泡一张聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。当凝胶电泳完成后，用转移缓冲液冲洗膜，并将一块预先浸泡过的纤维垫放置于半干式转膜装置细胞的底部。

随后放置PVDF膜、凝胶以及第二块预浸泡的纤维垫。然后将电流设置为150毫安，持续1小时。蛋白转膜结束后，从转膜装置中取出膜，用蒸馏水短暂漂洗。

将清洗后的膜蛋白面朝上放入小型染色盒中，加入TBS（Tris缓冲盐水）封闭液，室温下轻轻摇动孵育1小时。封闭孵育结束后，将膜与抗酵母组蛋白及修饰特异性抗体在4°C的TBS中4°C过夜孵育，并同时使用适当的核蛋白上样对照抗体。

次日早晨，用含0.1%吐温-20的TBS溶液在室温下振荡洗涤膜，每次5分钟，共洗涤4次。最后一次洗涤后，在室温下用适当的二抗孵育1小时。随后用TBST振荡洗涤4次，每次5分钟，最后再用TBS单独振荡洗涤1次，每次5分钟。

然后在荧光 Western 印迹成像系统中对印迹成像两分钟。此处显示了在固体和液体培养物中生长抑制的情况，在含半乳糖的融合肉瘤病毒过表达模型中观察到对酵母生长的显著影响。在融合肉瘤病毒过表达模型中，组蛋白水平显著降低；而在 TAR 结合蛋白 43 过表达模型中，组蛋白乙酰化水平显著升高，而这种变化在融合肉瘤病毒或 α-突触核蛋白过表达模型中均未观察到。

在α-突触核蛋白过表达模型中，组蛋白水平也存在显著下降。在该蔗糖调节实验中，用于诱导FUS（fused in sarcoma）过表达的半乳糖浓度越低，在固体和液体培养中观察到的毒性也越低。重要的是，FUS过表达水平越低，组蛋白水平下降的幅度也越小。

在执行本实验方案时，必须对每个样品中的酵母用量进行标准化，以便准确比较组蛋白翻译后修饰水平。2-巯基乙醇应在通风橱中使用，以避免吸入。若使用丽春红染色，必须按规定妥善处理废液。