小鼠模型在转变过程中的应用 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程

本方法描述了一种新的小鼠模型，用于研究肺炎链球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病性病原体的过程。该模型更接近于人类体内发生的情况，可作为识别易感宿主中继发性肺炎链球菌性肺炎潜在治疗靶点的重要工具。

该模型可重现衰老过程中的易感性，因此可用于理解宿主在衰老过程中哪些方面出现功能缺陷，从而帮助我们为易感的老年宿主定制治疗方案。由于不同肺炎链球菌菌株形成生物膜所需时间不同，培养肺炎链球菌生物膜具有挑战性。

我的建议是在开展动物实验之前，先尝试培养生物膜。当H292细胞达到100%汇合时，用PBS洗涤细胞三次。然后每孔加入250微升4%多聚甲醛固定细胞，在冰上孵育1小时，或在4摄氏度下过夜。

将感兴趣的肺炎链球菌菌株划线接种于血琼脂平板上，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下培养过夜。次日，从平板上挑取细菌接种至新鲜的化学成分明确培养基（CDM）加Oxyrase中：加入一毫升CDM加Oxyrase洗涤平板上的细菌，用一毫升移液器枪头侧面轻轻刮下菌落，注意避免刮破琼脂。将细菌培养物用CDM加Oxyrase稀释至起始OD600为0.05。

然后将细菌在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于松盖的50毫升锥形管中培养至OD值达到0.2。接着涡旋振荡细菌培养管。取0.5毫升培养物接种到固定的H292细胞上，并向每孔加入另外0.5毫升CDM加Oxyrase培养基。

向不含细菌的对照孔中加入CDM和Oxyrase。将培养板在34摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育48小时。在初始接种后的每12小时，轻轻更换0.5毫升培养基，补充新鲜的CDM加Oxyrase。

注意不要破坏生物膜的形成。观察培养板底部是否有生物膜形成，并随着培养时间的延长，注意观察因生物膜生长导致的浑浊度逐渐增加。48小时后，移除上清液，并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）将生物膜清洗两次。

然后将生物膜重悬于1毫升新鲜CDM中，并剧烈吹打混匀以使生物膜脱离。针对每种细菌菌株，将所有孔中的培养物收集至一个50毫升离心管中。通过轻轻反复倒置拧紧盖子的离心管数次，充分混匀。

接下来，加入等体积的40%甘油和CDM，以获得终浓度为20%甘油的细菌悬液。将1毫升分装至微量离心管中，于干冰上快速冷冻，保存于-80摄氏度。将生长生物膜的分装样品置于冰上解冻，并在1,700 ×g离心5分钟。

小心移除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。然后用一毫升磷酸盐缓冲液重悬沉淀，再次离心。移去上清液，将沉淀重悬于达到所需浓度所需的体积中。

将稀释后的接种物各5微升（含5×10⁶菌落形成单位，即CFU）通过移液方式滴入C57黑六雄性小鼠的每个鼻孔，进行鼻内接种。接种后，牢固握住小鼠并固定其头部，直至液体完全吸入。病毒解冻后，用PBS将其稀释至所需浓度。

在麻醉前，将眼用润滑剂涂抹于小鼠眼部。麻醉后立即使用钝头镊子将小鼠舌头拉出口腔，通过气管内滴注50微升含20个噬斑形成单位（PFU）的甲型流感病毒（IAV）进行感染。苏醒后，采用前述接种方法，经鼻腔接种10微升含200 PFU的IAV。

取肺时，使用解剖剪剪开暴露的肋骨两侧，轻轻将肋骨向上朝小鼠头部方向提起，以暴露心脏。将连接在预先装有 PBS 的 10 毫升注射器上的 25 号针头插入右心室，开始缓慢灌注。观察肺组织是否出现漂白现象，以此作为灌注成功的指标。

缓慢灌注，避免破坏肺组织。用镊子提起心脏，并剪开以分离肺和心脏。分离后，用镊子夹起肺的所有叶，放入含有无菌 PBS 的培养皿中冲洗，以去除任何残留血液。

在培养皿中，将肺组织切碎成小块并充分混匀。取一半肺组织匀浆用于测定细菌CFU或病毒PFU，并将其转移至预装有0.5毫升PBS的圆底15毫升离心管中，用于后续匀浆处理。取另一半肺组织用于流式细胞术分析，并将其置于未经组织培养处理的24孔板中，每孔预先加入0.5毫升RP10培养基。

在室温下放置直至处理。为均质化采集的组织，通过将均质器探头浸入70%乙醇中并以60%功率开启均质器30秒来清洗探头。再用无菌水重复此步骤10秒。

每种组织匀浆处理一分钟。为计数细菌数量，将系列稀释液接种于血琼脂平板上。计算总菌落形成单位（CFU）时，使用10 µL进行涂布，并记录每个样本的最终体积（单位为mL）。

将鼻咽样本接种于添加了每毫升3微克庆大霉素的血琼脂平板上，以选择性促进肺炎链球菌（S. pneumoniae）的生长并抑制其他微生物的生长。在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育过夜。进行流式细胞术时，向含有肺组织样本的24孔板的每孔中加入500微升消化缓冲液。

将培养板孵育45分钟至1小时。接着，使用P-1000微量移液器将消化后的肺组织转移并置于滤膜上。然后用一支3毫升注射器的推杆碾压样本。

生物膜生长的肺炎链球菌接种物可导致稳定的肺炎链球菌定植，局限于鼻咽部，同时避免系统性扩散。在肺炎链球菌与甲型流感病毒（IAV）共感染小鼠中，疾病表现取决于细菌菌株。尽管各菌株在感染后48小时鼻咽部的细菌数量无显著差异，但肺炎链球菌TIGR4和D39菌株（EF3030除外）已扩散至肺部。

感染肺炎链球菌TIGR4的小鼠中有40%出现细菌向肺部播散，其中一半发展为菌血症。感染肺炎链球菌D39的小鼠则有100%出现肺部播散，其中一半发生菌血症。在总体生存率追踪中，无论细菌菌株如何，共感染小鼠的生存率显著低于单独感染肺炎链球菌的小鼠。

该模型还被用于评估感染IAV后肺部各种免疫细胞的存在情况。细菌菌株D39和TIGR4引起循环中炎性免疫细胞（如中性粒细胞和单核细胞）向肺组织的浸润显著高于基线水平，而EF3030则未引起明显增加。单独IAV感染即可导致自然杀伤细胞（NK细胞）和γδ T细胞等免疫细胞浸润显著高于基线水平。

在病毒攻击前经鼻腔感染肺炎链球菌的小鼠中，这些抗病毒反应显著减弱。在单一感染的小鼠中，年轻组与老年组之间的病毒滴度没有差异。老年小鼠出现疾病症状的时间更早，且症状明显更为严重，并在24小时内更快死亡，而年轻对照组则对感染具有更强的耐受性。

将定植与疾病分为不同的阶段，有助于我们研究在疾病发展不同阶段中重要的免疫反应以及细菌或病毒因素。我们希望其他实验室能够采用此模型，以研究在疾病发展不同阶段及不同宿主中，其他多微生物相互作用和宿主-病原体相互作用。