基于简单快速滚环扩增的粗生物样品中拓扑异构酶1活性检测

本方案展示了一种通过滚环扩增方法快速、简便地检测粗提样品中拓扑异构酶1活性的技术。该方法的主要优势在于操作简单，即使无经验的研究人员也能轻松掌握；并且在使用粗提物时，其灵敏度高于其他基于凝胶的检测方法。本方案的应用范围广泛，可从药物处理反应的测定，扩展到具有潜在抗癌或抗感染疾病作用的小分子化合物的筛选。

本实验操作将由本实验室的开发专家 Karol Mizielinski 演示。首先，将定制设计的硅胶隔离网格附着于功能化载玻片上，从而制成点阵制备装置。按压硅胶网格，以避免玻璃表面与硅胶之间产生气泡。

接下来，通过在1倍打印缓冲液中加入5微摩尔的5'氨基引物来制备引物混合液。然后将4微升该混合物加入每个孔中，并将孔板置于含有饱和氯化钠的杂交室中孵育。为生成闭合环状底物，向16微升1倍拓扑异构酶反应缓冲液中加入2微升5微摩尔的拓扑异构酶1特异性底物以及2微升重组拓扑异构酶1酶或制备好的细胞提取物。

将该环状混合物在37摄氏度下孵育30分钟，然后加入2微升1% SDS以终止酶反应。将制孔器浸入盛有预热至50摄氏度缓冲液1的托盘中。用移液器将缓冲液加入孔内，确保制孔器内部无气泡残留，随后将托盘在50摄氏度下孵育30分钟。

孵育后，移除缓冲液1，并用蒸馏水洗涤两次，每次洗涤之间剧烈振荡一分钟。去除水后，接着将预热至50摄氏度的缓冲液2加入托盘中，然后按照缓冲液1的操作方法对孔板模具进行孵育和洗涤。随后，用70%乙醇洗涤孔板模具，剧烈振荡一分钟，并使用压缩空气使装置干燥。

进行杂交时，将4 µL制备好的环状混合物加入到每个相应的孔中，并将孔板置于含有蒸馏水的湿盒内，在37 °C条件下孵育1小时。孵育结束后，依次用缓冲液3、缓冲液4和70%乙醇各洗涤孔板1分钟，然后使其自然晾干。随后，制备并往孔板的每个孔中加入4 µL的RCA混合物，在湿盒中37 °C孵育2小时。

为了在显微镜下观察扩增的荧光滚环产物，首先用缓冲液3、缓冲液4和70%乙醇洗涤载玻片。用压缩空气吹干载玻片，然后将其粘附到显微镜载片上。用记号笔标记出各孔的位置，随后用镊子移除硅胶网格。

为了便于相机成像，使用两微升不含 DAPI 的封片剂将样品封片，并加盖盖玻片。使用荧光显微镜配合 60 倍油镜物镜和相机对样品进行观察。成像后，将图像导入 ImageJ 软件，依次点击 Image（图像）、Stacks（堆栈）和 Images to Stack（图像转为堆栈）以合并图像，然后将图像类型更改为 8 位。

设置阈值时，点击图像，调整，然后选择阈值。将下限设为 255，并调节上限，使仅右侧信号显示为红色，背景为黑色。逐帧浏览单个图像，确保其与调整阈值前的图像一致。

在真实信号开始消失之前，确保将阈值设置为尽可能低。为计数信号，单击“分析”，然后选择“分析颗粒”，并确保图像J设置中的“汇总”字段已被勾选。向每个孔中加入4 µL稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体，在湿盒中于15至25 °C孵育50分钟。

孵育结束后，用缓冲液5洗涤微孔板三次，每次三分钟，然后使其干燥。为检测化学发光，向各孔中加入2微升新配制的ECL鲁米诺和过氧化氢混合液，并使用CCD相机或X射线胶片对玻片进行成像。或者，若使用TMB显色，在缓冲液5洗涤后移除硅胶网格，并在整张玻片上加入400微升TMB溶液。

将载玻片置于湿盒中，静置5到10分钟以显色。显色完成后，用70%乙醇洗涤载玻片，并用相机或手机拍照，以便使用ImageJ软件进行分析。将图片导入ImageJ，点击“Image Type”，然后选择“8 bit”，将图像类型更改为8位。

使用工具栏中的矩形绘制工具限定测量区域，分别测量条带并绘制所需区域。通过单击“分析”然后选择“测量”来测定光密度。接着，将最初绘制的区域移动到下一个条带并进行测量。

测量所有条带的强度后，使用所需的软件绘制数据。此处显示的是通过荧光扫描仪读数确定的拓扑异构酶1活性，定量结果清晰可见。该读数方法的检测限为12.5纳克，此处还展示了使用荧光显微镜读数获得的代表性图像及相应的定量结果。

该检测方法的检测限为0.1纳克，增强化学发光法和比色法的检测阈值为6纳克。使用相同的检测方法时，ECL法的检测限为1,250个细胞，TMB法为312个细胞。当从结肠直肠腺癌来源细胞的提取物中测定拓扑异构酶1活性时。

以药物筛选应用为例，在喜树碱或二甲基亚砜存在下检测了拓扑异构酶1的活性。定量结果表明，喜树碱可抑制拓扑异构酶1介导的底物环化，结果符合预期。该实验方案简单，仅需特别注意洗涤步骤和反应孵育时间。

还可以利用Reid方法研究药物如何抑制拓扑异构酶1的活性，该方法灵敏度高且操作简便，可用于快速筛选潜在的拓扑异构酶1抑制剂，并将拓扑异构酶1活性作为癌症药物反应的生物标志物。