一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿DNA的运输

本实验的总体目标是建立一种简单、稳定且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿 DNA 的运输过程。首先，通过将生物素标记的寡核苷酸与 λ-DNA 连接，制备生物素标记的 λ-DNA。第二步，采用一步反应法，制备聚乙二醇（PEG）功能化的盖玻片。

接下来，通过将带有预切微通道的双面胶带夹在聚乙二醇（PEG）功能化的盖玻片与含有进样和出样孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基片之间，构建高通量流动池。最后一步是利用延时全内反射荧光（TIRF）成像技术追踪流动通道中单个荧光分子的运动轨迹。为了识别沿流动拉伸的λ-DNA扩散的单个分子轨迹，采用一种可靠且高效的定制单粒子追踪软件来分析原始荧光图像。

与替代方法相比，该检测方案的主要优势在于盖玻片制备的可靠性更高、通量更大、样品制备所需人工操作时间更短，以及非监督式数据分析更加高效。本实验操作将由我实验室的博士后 Dr.Kan Xiong 进行演示。在开始本检测之前，请按照方案文本所述准备好所有必要的试剂。

将0.5 毫克/毫升的λ-DNA储存液加热至65°C，持续60秒，然后立即放入湿冰中。在微量离心管中，将100 微升λ-DNA溶液与2 微升10 微摩尔的生物素标记寡核苷酸混合。将混合物在65°C加热60秒，然后缓慢冷却至室温。

将混合物置于冰上。加入11 µL T4 DNA连接酶反应缓冲液，轻轻混匀。然后加入2 µL相当于800单位的T4 DNA连接酶，轻轻混匀。

将混合物在16摄氏度下孵育两小时，或在4摄氏度下过夜。使用标称分子量截留值为100千道尔顿的离心过滤管纯化产物。将1号盖玻片置于染色缸中，用95%乙醇超声处理10分钟，然后用超纯水冲洗三次。

将染色缸中加入一摩尔氢氧化钾，再次超声处理10分钟，然后用超纯水冲洗三次。重复此循环两次。在洁净干燥的氮气气流下干燥盖玻片。

通过在900毫托压力下进行5分钟的空气等离子体处理，进一步清洁并干燥盖玻片。将盖玻片与50微升溶解于95%乙醇中的25毫克/毫升硅烷-聚乙二醇-生物素溶液在室温下孵育2小时。用超纯水洗去多余的聚乙二醇，并在洁净干燥的氮气流下干燥涂有聚乙二醇的盖玻片。

使用 CAD 软件设计流道，并用胶带切割机在双面胶带上切割出流道。清除流道内的胶带残留物。制备 PDMS 块时，将 45 克 PDMS 与 5 克交联试剂使用混合器充分混合。

将混合物倒入两个100毫米的培养皿中，置于真空室中约30分钟，直至所有气泡消失。将培养皿放入80摄氏度的烘箱中约两小时，直至PDMS固化。裁剪出一块与双面胶膜上预切通道尺寸相匹配的PDMS片。

撕下双面胶带的一层保护膜，将其粘附到PDMS切片的平整面上。使用23号针头的活检打孔器在PDMS切片上打出出口和入口孔。撕下双面胶带的另一层保护 膜，将其粘附到盖玻片的功能化表面。

将组装好的流动池固定在显微镜载物台插件上。将所有预先脱气的试剂加入储液槽中，储液槽通过Tygon管路连接至电磁阀，再通过另一段管路连接至PEEK管路，以防止试剂回流。试剂的流动由电磁阀控制，电磁阀通过脚本编程应用程序进行调控。

通过流入空白缓冲液来预润一个流路通道。将另外三根PEEK管插入进样孔中。注意避免在通道内产生气泡。

将Tygon管通过一段短的PEEK管从出口连接至样品废液容器。注入0.2 毫克/毫升的链霉亲和素溶液，孵育5分钟。随后注入空白缓冲液，洗去未结合的链霉亲和素。

流加浓度为1毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液，并孵育1分钟。然后流加空白缓冲液以洗去未结合的牛血清白蛋白。接着流加100皮摩尔的生物素标记λ-DNA溶液，并孵育10分钟。

然后流入空白缓冲液以洗去未结合的λ-DNA。为检测PEG功能化盖玻片的质量，加入DNA染色剂（如SYTOX Orange染料）并开始荧光成像。若盖玻片质量良好，则拉伸后的λ-DNA密度会较高。

此外，调节TIRF角度，以获得几乎完全流动拉伸的λ-DNA成像中最高的信噪比。为追踪单个分子的轨迹，首先在新通道内开始孵育，然后使用注射泵以足够高的流速引入亚纳摩尔浓度的荧光标记分子，并以100赫兹的帧率采集延时荧光图像。通常在一个视野中采集10,000帧，同时采集多个视野的视频。

最后，再次流入DNA染色染料，以确认DNA仍可被流动拉伸。将使用定制的单粒子示踪软件来识别单个分子沿DNA扩散的轨迹。该软件将首先高精度地确定单个粒子的质心位置。

去除附着在盖玻片表面的颗粒，然后将不同帧中的颗粒进行连接，形成延时轨迹。根据这些轨迹，将估算一维扩散常数。开始数据分析时，打开脚本编程应用程序，并进入单颗粒追踪软件的目录。

打开一个名为 largedataprocess3.m 的脚本。需要定义的一个重要参数是单粒子检测的阈值。为了确定最佳阈值，运行 determine_threshold_value。

m 脚本。该脚本将可视化阈值如何影响单颗粒检测。在确定最佳阈值后，运行 largedataprocess3。

运行 m 脚本。单颗粒追踪分析完成后，将通过运行 trajectory_filtering.m 脚本来过滤原始轨迹。

构建了一个图形用户界面（GUI）以可视化过滤步骤。在 GUI 面板中，将沿 DNA 的最小位移（MinXDisp）设置为两个像素，将垂直于 DNA 的最大位移（MaxYDisp）设置为两个像素。

将最小帧数 minFrames 设为 10。将三联体的最小状态数 minTriplets 设为 10。将沿 DNA 的最小扩散常数 D_par 设为零。

将垂直于 DNA 的最大估计扩散常数 D_trans 设置为每秒 10 兆碱基对的平方。将最小统计参数 Chi2 Stat 设置为负五。将沿 DNA 方向的位移与垂直于 DNA 方向的位移之比 MinX/Y 的最小值设置为二。

所有通过这些筛选参数的原始轨迹将列于表一中，未通过的将列于表三中。单击表一中的轨迹编号，该轨迹将在图一和图二中显示。

单击播放按钮以查看原始荧光图像。如果该轨迹为单分子滑动轨迹，请单击“添加到表格2”。最后，关闭图形用户界面时，所有添加到表格2的轨迹将被保存。

将通过所有筛选步骤的轨迹合并在一起，用于估算平均扩散常数。要计算平均扩散常数，只需运行脚本 calculate_mean_diffusion_constant.m。该方法将使许多从事体外单分子生物物理学研究的人员受益。