利用自发荧光成像评估红藻生理状态

本共聚焦显微镜实验方案将有助于通过微藻色素的自发荧光，解读来自极端环境且在实验室中生长缓慢的微藻的生态行为与适应机制。该技术具有非侵入性，且不使用化学试剂，可最大限度减少人为假象。了解自养生物色素的表现及其相应生长情况，将有助于设计相应的控制方法，这对于旅游洞穴及建筑遗迹的保护具有重要意义。

通过将集胞藻（Chroothece mobilis）从琼脂培养基转移至海水培养基或SWES液体培养基，开始制备接种物。在20摄氏度、低强度白光条件下，以16小时光照/8小时黑暗的光周期培养所有藻液，持续两周，期间不进行振荡，直至达到所需细胞密度。取1毫升处于指数生长期、细胞密度为每毫升5 × 10³个细胞的培养物，接种于24孔板中，用于不同实验。

为了重现单色光效应，使用允许绿光通过的绿色滤光片，其透射波长范围为470至570纳米，峰值位于506纳米波长处；对于红光，则使用滤光片调节至590至720纳米范围，峰值位于678纳米。将细胞培养物暴露于该光照条件下持续两周。开启倒置共聚焦激光扫描显微镜的所有组件，包括激光器。

将24孔板中每个实验孔的SWES生长培养基中的细胞转移至35毫米玻璃底培养皿中，用于成像。选择63倍、数值孔径（NA）为1.30的甘油浸没物镜，并在镜头上滴加甘油。随后，将培养板放置于显微镜载物台上，确保在图像采集过程中样品不发生移动。

将样本置于光路中心，并通过选择荧光强度最高的层面，对准细胞中心进行聚焦。完成后，打开图像采集软件，在采集模式下拉菜单中选择 XY lambda。选择561纳米激光激发波长，8位动态范围，以及1024×1024像素。

在570至760纳米范围内，以10纳米带宽和4纳米波长步长采集荧光发射光谱。将针孔设置为1个空气单位，并运行lambda扫描采集。在不同视野以及红光和绿光不同条件下重复此过程后，保存所有数据。

获取lambda扫描后，单击软件顶部的“定量”窗口，以评估采集到的荧光发射光谱。进入打开项目的窗口，选择一个XY lambda文件。在成像软件中选择堆叠轮廓分析，并在细胞中心定义一个边长为四微米的正方形区域作为感兴趣区域，用于分析平均荧光强度。

在不同条件下对其他细胞重复该过程之前，先导出数据和 CSV 文件。接下来，打开 CSV 文件，通过分别选择 CSV 文件中藻红蛋白、藻蓝素、别藻蓝蛋白和叶绿素 A 对应的藻红蓝素、C-藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白及叶绿素 A 的最大荧光数据，来确定所有测量兴趣区域的不同荧光发射峰。完成后，创建一个新表格，汇总从各藻胆蛋白和叶绿素峰获得的所有最大荧光值，并将数据绘制成图表。

观察到平均荧光强度存在显著差异。当细胞暴露于单色绿光下时，藻红蛋白藻蓝胆素的平均荧光强度显著降低。相比之下，与对照组相比，红光条件下未观察到差异。

绿光对别藻蓝蛋白和叶绿素A产生了相反的影响，由于捕光复合体数量增加或捕光复合体之间连接性增强等原因，其平均荧光强度显著升高。红光则导致别藻蓝蛋白和叶绿素荧光的增加不显著。为了研究不同培养条件对培养细胞的影响，必须使用完全相同的显微镜设置进行测量。

可以分析与自体荧光生物培养相关的其他环境参数，以及可见光谱范围内的荧光信号。该技术是一种研究含有多种自体荧光色素生物的非常强大的方法。