利用流式细胞术优化分子探针以测定光合生物（Microcystis aeruginosa）的细胞死亡率

本实验的总体目标是演示如何建立一种利用流式细胞术和分子探针有效分析蓝细菌生理状态的实验方案。该方案有助于解答有关微生物群落细胞生理学的关键问题。本方法的主要优势在于，经过优化的荧光探针方案能够实时地区分单个蓝细菌细胞的生理状态。

演示本实验操作的是伯恩茅斯大学细胞计量实验室的博士生 David Hartnell。实验开始前，将一支空溶血管放置在样本进样探针上，然后点击“unclog”。

然后进行反向冲洗，以启动流式细胞仪的清洗程序。反向冲洗结束后，将一根新的溶血管（内含2毫升超纯过滤水）装载到样本进样探针（SIP）上，设置时间限制为10至15分钟，流体速度设为快速。接下来，选择一个新的数据单元，并设置相应的荧光和光散射阈值，以降低背景噪声。

然后点击运行。如果每秒总事件数不低于制造商推荐值，则以快速模式运行两毫升去污溶液两分钟，并重复反向冲洗和超纯水冲洗步骤。

为制备铜绿微囊藻（M. aeruginosa）的初级单培养物，将98毫升超纯过滤水与2毫升藻类培养基混合后，于250毫升烧杯中在120摄氏度条件下高压灭菌20分钟。当培养物处于高稳定密度状态时，通过涡旋振荡使2毫升细胞悬浮液充分分散，随后将细胞转移至样品进样探针下方。

通过光学显微镜确认细胞均匀分散。然后在流式细胞仪软件中选择直方图模式，以记录前向散射光数据，并点击“log”按钮，使x轴数据以对数尺度显示。

在另一个输出中，设置另一个对数轴直方图以记录铜绿微囊藻细胞的天然荧光。接下来，选择能够激发藻蓝蛋白的光源，以及能够过滤所产生的荧光发射信号的检测器。为了以最高分辨率进行记录，应选择最接近目标生物核心尺寸的设置。

并设置相对较慢的流速。在采集数据之前，设置阈值以排除由电子背景噪声或细胞样本碎片引起的光散射和荧光信号。然后选择一个新的数据细胞。

使用前向散射和侧向散射参数在对数尺度上创建密度图，然后点击运行。接着将前向光散射和天然荧光门控应用于前向散射与侧向散射数据，以排除任何低水平的散射信号，并仅包含相对较高荧光的藻蓝蛋白信号。随后持续收集事件直至样品运行完毕，并利用该数据确定初始细胞数量。

为了优化分子探针的细胞摄取，将先前准备的单层培养物的一半暴露于适当条件下，以生成死亡对照。检测样品微环境的变化，以确认培养物的死亡。然后按照刚刚演示的方法解离集落形成。

接下来，选择一个488纳米的激光器，并配以能够检测绿色和橙色核酸探针荧光信号的检测器；同时使用640纳米的激光器，通过相应的检测器记录藻蓝蛋白信号。在新的数据表中，设置一个以正向散射和侧向散射参数为基础的密度图。

然后使用相应的分子探针光学检测器通道创建一个直方图。一个用于检测藻蓝蛋白的发射信号，另一个用于前向散射事件，均采用对数刻度。使用不同浓度和孵育时间运行蓝细菌样品。

在前向散射直方图中设置一个门，仅包含目标生物细胞大小的事件，并将其应用于相应的荧光探针通道。接着，在荧光探针通道中，针对直方图中的最高峰创建另一个包含性软件门。

随后将相应的阳性探针荧光信号门控至密度图上。将荧光信号数量与死细胞对照组的细胞数量进行比较，以确定在不产生非特异性染色的前提下，细胞核酸探针摄取的最高百分比。为检测内在或非特异性细胞染色引起的荧光干扰重叠，选择50%活细胞与50%死细胞的混合培养数据。

然后移除荧光门控。应用门控，仅在藻蓝蛋白通道的直方图上包含目标生物细胞大小的前向散射直方图。将藻蓝蛋白信号最高和最低的峰分别设门，并将其标记为“活”和“死”。

然后分别将门控应用于活细胞和死细胞的藻蓝蛋白信号，并记录两者的平均波长。为了确定该方案的灵敏度，计算阳性死细胞分子探针荧光的平均波长与内在非特异性活细胞信号平均波长的比值。

最后，选择经过优化的实验方案，该方案应在无非特异性染色的情况下，使最多数量的死细胞被染色。在这些图中，展示了处于指数生长期的铜绿微囊藻（M.aeruginosa）批量培养物的代表性前向光散射和侧向光散射输出结果，分别反映细胞大小和内部复杂性。可通过在前向光散射输出的特定点之间进一步筛选数据来完成设门分析。

藻青蛋白在红光光源激发下会产生强烈的信号，可用于进一步圈选目标细胞群体。根据前向散射光和荧光信号，可对原始输出数据进行设门，获得针对铜绿微囊藻样品的特定数据，从而完成最终的细胞计数。当混合活细胞（高色素含量）和死细胞（低色素含量）对照样品时，自发荧光的逐渐减弱趋势变得清晰可见。

在细胞膜受损的细胞中，核酸探针会产生额外的信号，可通过流式细胞术观察，并进一步通过落射荧光显微镜确认。两种探针在0.05至0.5微摩尔浓度之间，活细胞与死细胞之间的荧光区分度随时间增加，但在1至100微摩尔浓度之间则有所下降。事实上，绿色核酸探针的最佳浓度似乎为0.5微摩尔，孵育时间为30分钟。

对于橙色核酸探针，最佳浓度为在10分钟孵育时间内使用1微摩尔。一旦掌握，只要操作得当，每种分子探针的优化过程可在一天内完成。在进行该实验时，重要的是要始终注意将探针保存在稳定的环境中，确保适宜的温度、pH值和光照条件。

该技术问世后，为微生物学领域的研究人员探索浮游植物群落的异质性提供了可能。观看视频后，您现在应该已充分了解如何建立利用流式细胞术和分子探针评估细胞生理状态的最佳实验方案。请务必注意，操作分子探针和有毒生物体可能具有极高危险性，在执行该实验流程时，必须采取相应预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备（P.P.E），并充分了解COSHH相关材料的安全信息。