利用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿路上皮中表达外源基因

本方案描述了可在天然膀胱尿路上皮中表达cDNA或siRNA的研究方法。该技术的主要优势在于操作相对简便，能够高效地在尿路上皮中表达cDNA和siRNA，且耗时较短。该技术最难的部分在于导管插入操作。

然而，一旦掌握，该整体技术相对容易精通。演示该操作的将是本实验室的四级研究专家 Giovanni Ruiz。首先，将麻醉后的小鼠放置在靠近鼻罩的加热垫上。

在整个实验过程中保持动物处于麻醉状态。通过脚趾夹捏确认小鼠已完全麻醉。为防止空气进入膀胱，使用无菌移液管或注射器将无菌 PBS 注入静脉留置针的塑料导管部分及其连接头内，使其充满。

将动物置于仰卧位后，用70%酒精擦拭尿道外口。然后用精细镊子轻轻夹住构成尿道外口的组织，并将其垂直向外牵拉。将无菌导管插入尿道外口。

用另一只手小心地将导管垂直插入尿道口约三到四毫米。然后将已插入外尿道口的导管朝动物尾部方向下压，以使其更容易进入经由耻骨下方通向膀胱的尿道部分，最终进入膀胱。让膀胱中的尿液自然流出。

通过在腹部下区的膀胱隆起处进行按摩并轻柔下压，实施克雷德法（Crede's maneuver）以排出残留尿液。为使尿路上皮易于转导，将装有磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌1毫升注射器连接至导管接头，冲洗小鼠或大鼠膀胱。向小鼠膀胱内注入100 µL无菌PBS。

将注射器从导管接头取下后，让 PBS 自然排出。使用无菌的 1 毫升注射器，向小鼠膀胱内灌注 100 微升溶于 PBS 中并经 0.2 微米滤器过滤除菌的 0.1% N-dodecyl-beta-D-maltoside。通过保持注射器原位，使 N-dodecyl-beta-D-maltoside 在膀胱内保留 10 分钟。

通过取下注射器并让其自然排出，将十二烷基-β-D-麦芽糖苷从膀胱中去除。为将病毒导入膀胱，将一支无菌的1毫升注射器连接至导管接头，并向膀胱内注入5,000,000至100,000,000 IVP的腺病毒，该病毒已用100微升无菌PBS缓冲液稀释（小鼠）或450微升（大鼠）。30分钟后，取下注射器，使病毒溶液排空至一次性吸水垫上。

用吸水纸巾擦去残留的病毒溶液，并将垫料和纸巾丢弃至生物危害废物容器中。为使动物恢复，停止异氟烷气流。在将动物放回笼中前，应确保其已恢复并能完全自主活动，特别是对于群养动物更需注意。

在处理后12至72小时内，使用mRNA原位杂交、蛋白质印迹或免疫荧光等方法分析转基因表达的效果。对尿路上皮裂解物进行蛋白质印迹分析，结果显示在转导的膀胱尿路上皮中存在V5标签的人类生长激素表达，而在未转导的膀胱中则无表达。通过使用识别人类生长激素或V5表位标签的抗体进行免疫荧光染色，也证实了该表达。

Western blot 分析证实，在转导了腺病毒的大鼠中存在 Claudin-2 的表达，而在转导了对照性编码 GFP 病毒的大鼠中则无表达。免疫荧光分析进一步证实，在转导了编码 Claudin-2 cDNA 病毒的尿路上皮伞细胞中存在外源性 Claudin-2 的表达。通过免疫荧光和共聚焦显微镜对完整铺片或横切尿路上皮进行检测，发现 Tight Junction Protein 1 中存在紧密连接结构以及 Claudin-2 在细胞质内的胞内积聚现象。

图像结果显示，通过计数转导的伞状细胞数量，发现转导效率接近95%；在整个膀胱壁中，仅有尿路上皮被转导，灌注的腺病毒未靶向其他任何组织。导尿操作对于该实验方案的顺利实施至关重要。该技术可使研究人员研究正常的尿路上皮生物学特性，同时也有助于理解蛋白质过表达或低表达所导致的疾病状态。