Saccharomyces cerevisiae 单倍体交配效率的测定

本方案是一种用于量化不同酵母菌株和物种之间交配效率的简单方法。该方法操作简便、结果可靠且高效，可推广应用于任何酵母菌株。

本研究中描述的方法可用于理解酵母中物种形成的过程。此外，我们所描述的菌株在设计涉及基因流的实验时可能特别有用。该方法的优势在于其操作极为简便。

根据所使用的特定菌株，可能需要对孵育时间等条件进行轻微调整。从冻存菌种中复苏单倍体A和Alpha型，通过将酵母接种物划线接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上开始。在30摄氏度下培养48小时，以获得单菌落。

孵育后，从YPD平板上挑取单菌落接种于5毫升YPD培养基中，在30摄氏度、250 RPM振荡条件下孵育48小时。经过此孵育阶段后，细胞处于生长的稳定期。在新的YPD平板上，绘制交配效率网格，即一个1厘米×1.5厘米的矩形，均分为三个小格，每格尺寸为1厘米×0.5厘米。

在最左侧和最右侧的矩形区域中，分别接种5 µL两种交配型的YPD培养物。该接种量大约相当于每个区域含有5 × 10⁵个单倍体细胞。将平板置于30 °C培养24小时。

为混合等量的酵母细胞，使用无菌牙签从外侧方格中刮取约三分之一的酵母菌落，并将刮取的细胞重悬于无菌1.5毫升离心管中的20微升水中。对每个单倍体菌株均进行此操作。然后，取5微升该悬液加入2毫升水中稀释，并在600纳米波长下使用分光光度计测定其光密度。

根据光密度值以及每单位光密度每毫升的细胞数，将所需体积的两种单倍体细胞加入一个新的无菌1.5毫升离心管中。使用移液器充分混匀。此悬浮液的终体积通常约为6至8微升。

接下来，将该悬液接种至中心方格区域。将培养皿在30摄氏度下孵育7小时，使单倍体细胞进行交配。孵育7小时后，用牙签或移液器吸头刮取中心矩形区域的细胞，并将其悬浮于2毫升无菌水中进行稀释。

进行进一步稀释，然后将细胞悬液涂布于YPD琼脂平板上以获得单菌落。涂板后，将YPD平板置于30°C培养36至48小时，以形成单菌落。每次交配实验应获得数百个单菌落用于筛选，以确保数据的统计学意义。

为了鉴定平板上的二倍体菌落，将单菌落分别划线转接到缺乏菌株所需氨基酸的双缺失培养基平板上。在30摄氏度下培养48小时，并计算交配效率（nu）。该实验方案的稳健性使得能够轻松区分SK1AM和ScAM两种菌株之间的交配效率差异。

尽管SK1菌株的交配效率非常高，但ScAM菌株的交配效率相对较低。当环境中不含葡萄糖作为主要碳源时，ScAM菌株的交配效率显著下降，表明交配是一个能量消耗较大的过程，而在替代碳源上生长会定性地降低交配效率。在允许交配不同时间后观察发现，最初四到五小时内未观察到任何交配现象。

在四到五小时后才首次出现二倍体细胞，表明在给定环境下完成交配过程所需的时间为此时长。此后，交配效率迅速提高。超过七小时后，交配效率的计算受到平板上开始发生有丝分裂生长的影响。

确保混合相同数量的两种单倍体。偏离此比例将导致该实验方案独立重复时结果出现差异。基因流动如何影响适应与物种形成仍是一个未解的问题。

由于在我们的菌株中，营养缺陷型标记被插入到 MAT 位点附近，这有助于回答这一重要问题。