利用线粒体与溶酶体荧光染料可视化线粒体自噬

该方法利用一种可穿透细胞的绿色荧光线粒体染料和一种红色荧光溶酶体染料，帮助观察活细胞中的线粒体自噬过程。线粒体自噬在维持线粒体稳态及细胞功能的多个方面发挥重要作用。该技术可能为线粒体相关疾病的治疗提供新途径。

该实验步骤并不复杂。捕获清晰的图像对于计数线粒体与溶酶体的共定位至关重要。首先，在10厘米的细胞培养皿中加入10毫升达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育，并在显微镜下以100倍放大观察细胞。当细胞融合度达到80%至90%时，用2毫升杜尔贝科磷酸盐缓冲液洗涤细胞。然后加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，作用1分钟以解离细胞，随后加入2毫升DMEM培养基以终止反应。

将细胞悬液在100 G条件下离心3分钟，并将沉淀重悬于1毫升DMEM中。使用自动细胞计数仪和细胞计数板对细胞进行计数，然后将1.5 × 10⁶个细胞接种至一个新的含有10毫升DMEM的10厘米细胞培养皿中。进行线粒体自噬检测时，按上述方法制备细胞悬液，并用新鲜DMEM将细胞悬液稀释至每毫升含1 × 10⁵个细胞。

将两毫升稀释后的细胞悬液加入20毫米共聚焦培养皿中，并以十字形轻轻摇晃培养皿。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。通过稀释储备液制备染料的工作液。

向2毫升DMEM培养基中各加入2微升0.2毫摩尔的线粒体染料和2微升50微摩尔的溶酶体染料，以获得0.2微摩尔线粒体染料和50纳摩尔溶酶体染料的工作浓度。移除共聚焦培养皿中的培养基，并加入1毫升染色液以覆盖细胞。将细胞培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育20至30分钟。

设置共聚焦显微镜成像软件的参数。对于双激发图像，采用488纳米和543纳米的顺序激发，分别收集505至545纳米以及大于560纳米的发射光信号。从培养箱中取出含有染料的培养皿，向其中加入一毫升Krebs-Henseleit（KH）缓冲液。

为诱导线粒体自噬，使用含1 µM FCCP的KH缓冲液在室温下处理细胞10分钟，随后立即使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。在63X油镜顶部滴加适量镜油。将样品置于共聚焦显微镜的载物台上，并将其移至物镜正上方。

使用成像软件，在软件界面左上角点击“定位”选项卡以找到样品。为实验选择绿色滤光片组。使用粗调旋钮通过上下移动物镜快速对焦。

当通过目镜清晰可见细胞样本后，寻找并聚焦单个细胞区域，将其移至视野中央。在软件界面左上角点击“采集”选项卡以获取图像。预览时仅选择488纳米通道和1024×1024的帧分辨率。

单击左上角的“实时”选项卡以开始实时扫描。调整视野至最清晰状态，并通过向左或向右移动滑块来调节激光功率。将增益设置保持在600以下，以避免过度曝光。

将针孔值调整为156，增益值调整为545，数字偏移值调整为零。选择最佳视野，勾选两个通道，并选择帧分辨率为1024 × 1024。点击“拍摄”以获取二维图像，并保存所获取的图像。

本研究中，使用FFCP处理MEF细胞以诱导线粒体自噬，并进行共聚焦成像。图中显示了用绿色荧光线粒体染料标记的线粒体以及用红色荧光溶酶体染料标记的溶酶体的代表性细胞图像。当受损的绿色标记线粒体被红色标记的溶酶体吞噬后，绿色与红色荧光重叠，呈现出黄色共定位的线粒体-溶酶体结构。

黄色斑点对应于共定位的线粒体与溶酶体，代表正在进行的线粒体自噬，因此可通过计数来评估线粒体自噬的程度。配制线粒体和溶酶体染色用染料的工作液，以及在共聚焦显微镜成像时维持适当的细胞融合度，是需要牢记的关键步骤。该方法还可用于分析线粒体的数量和形态，这对于评估线粒体动力学具有重要意义。

线粒体自噬与多种人类疾病密切相关，该技术可用于探索线粒体自噬与人类疾病之间的关联。