双色相关光镜与电镜技术用于线粒体与溶酶体相互作用的可视化研究

线粒体功能障碍与多种疾病相关，尤其是神经退行性疾病和代谢紊乱。因此，如果我们能够理解溶酶体如何调控线粒体，将有助于开发新的治疗策略。在本方案中，我们展示了一种双色 CLEM 方法，用于可视化线粒体与溶酶体的接触。

相关光镜与电镜技术是一种结合了光学显微镜和电子显微镜优势的成像方法。在本方案中，我们利用双色探针最大化发挥相关光镜与电镜技术的优势，以可视化线粒体与溶酶体的接触。使用传统的电镜取样方法，很难清晰区分在溶酶体内降解的线粒体。

本研究展示了高分辨率的CLEM结果，清晰地显示了溶酶体和线粒体的效应结构域。采用双色成像方法，可准确区分溶酶体内线粒体效应物。我们的研究揭示了线粒体与溶酶体之间存在相互作用。

我们的研究发现，线粒体在不同外界应激条件下会以不同的方式与溶酶体相互作用。通过研究这些现象的成因及其调控因子，我们将更深入地理解细胞内线粒体质量控制机制。首先，在35毫米玻璃网格底培养皿中以每毫升1×10⁵的密度培养HeLa细胞。

第二天，使用转染试剂将处于30%至40%融合度的细胞与质粒共转染。转染后，用二甲基亚砜或U18666A和巴佛洛霉素A1处理细胞18小时。进行共聚焦成像时，移除培养基，立即加入250微升温度为30至37摄氏度的温热固定液。

立即去除固定液，加入1.5毫升新鲜固定液，冰上孵育30分钟。随后用1毫升冰冷的0.1摩尔卡考基late缓冲液洗涤细胞，每次10分钟，共洗涤三次。

接下来，加入1 mL冰冷的20毫摩尔甘氨酸溶液以淬灭醛基。将细胞在冰上孵育10分钟后，用冰冷的0.1摩尔卡考基缓冲液洗涤三次，每次10分钟。然后向样品皿中加入500微升Amplex Red溶液，并在冰上孵育5分钟。

随后，移除Amplex red溶液，并用0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液冲洗细胞三次，每次10分钟。使用共聚焦显微镜以3×3拼图扫描模式对目标细胞周围的区域进行成像。使用40倍物镜同时捕获微分干涉差（DIC）和荧光信号，以识别并记录网格培养皿上的网格线及字母标记。

使用40倍物镜在高倍镜下对目标细胞进行成像，并采集Z轴层扫图像。使用共聚焦显微镜对Amplex Red染色的细胞成像后，加入1毫升1%的还原性四氧化锇溶液，在4°C下孵育1小时。随后在4°C下用蒸馏水洗涤样本，每次10分钟，共洗涤3次。

在室温下依次用梯度乙醇溶液脱水，每次15分钟。然后按体积比3:1、1:1和1:3将乙醇与环氧树脂混合，每种混合液配制总量为300 µL。将每种环氧树脂混合液倒入培养皿中，在室温下孵育1小时。

接下来，通过填充新鲜的环氧树脂来制备包埋胶囊。将管子或胶囊在感兴趣区域倒置，并置于60摄氏度的烘箱中聚合48小时。然后将底部玻璃和聚合物块浸入液氮中以分离它们。

将样品块放入超薄切片机的样品夹中，并固定在修块位置。使用剃刀将树脂修整成围绕目标物体的矩形或梯形。将修整后的样品块重新放入样品夹，并调整金刚石刀片。

使用超薄切片机从包埋平整的细胞中切下约60至70纳米的超薄切片。将连续切片收集于经甲醛膜覆盖的载网槽上，随后在加热板上干燥。之后，先用对比染色剂染色两分钟，再用柠檬酸铅染色一分钟。

然后将载网放入透射电子显微镜（TEM）样品台中以进行观察。根据光学显微镜的微分干涉差（DIC）图像，确定目标感兴趣细胞，并在1,700倍放大倍数下，通过拼接重叠图像的方式对整个细胞区域进行成像。为了使用ImageJ Fiji获取HeLa细胞的关联光镜与电镜图像，首先启动ImageJ Fiji，点击文件、新建、TrakEM2空白项目，并选择存储文件夹以创建一个新的TrakEM2项目。将原始拼接图像数据拖放到工作区中，以打开拼接图像数据集。

单击鼠标右键并选择该线条，对本图层中的所有图像进行拼接，并建立弹性非线性块对应关系。然后单击“确定”，接受其余参数的默认值。接下来，单击鼠标右键并选择“导出”，然后选择“生成平面图像”，以创建拼接后的图像。

然后单击文件，选择“另存为”以保存图像。如需调整荧光图像的大小，请打开图像放大软件。单击文件，选择打开并选中该图像。

输入宽度和高度，以匹配电子显微镜图像的尺寸。选择在调整大小方法中要应用的算法。

单击文件并选择“另存为”以保存调整大小后的图像。打开 ImageJ Fiji，将调整大小后的荧光图像和拼接好的电子显微照片拖放到工作区中。点击插件中的“Big Data Viewer”和“Big Warp”以开始配准。

然后单击下拉菜单，选择荧光显微图像作为移动图像，电子显微图像作为目标图像。利用缩放、图像旋转和移动等功能，对比荧光显微图像与电子显微图像。按下键盘上的空格键切换至标记点模式，按鼠标左键在两幅图像中均能识别的至少三个标记点处进行标记。

标记完所有已识别的解剖标志后，依次点击文件、导出移动图像，然后点击确定。此时将弹出一个包含转换后荧光显微图像的新窗口。点击文件，选择另存为，以保存该转换后的荧光显微图像。

为叠加 CLEM 图像，将经变换的荧光显微图像和拼接的电子显微图像拖放到 ImageJ 工作区中。点击图像，选择类型，设置为八位灰度图像，以使荧光图像和电子显微图像具有相同的图像类型。

单击图像、颜色和合并通道以组合图像。然后单击文件并选择“另存为”来保存CLEM图像。

在经巴佛洛霉素 A1 处理的细胞中观察到线粒体被困在溶酶体内，表明自噬受到抑制且线粒体质量下降；而对照组细胞中则显示线粒体与溶酶体相互作用，但未被溶酶体吞噬。对照组细胞中观察到的线粒体紊乱表现为线粒体包围溶酶体，而非被溶酶体吞噬。U18666A 处理的细胞显示出线粒体与溶酶体之间的相互作用增加，部分溶酶体被线粒体吞噬。