使用自动化微生物鉴定系统直接进行微生物鉴定以在无需质谱技术条件下实施EUCAST RAST方法
2024年5月24日
EUCAST 已开发出一种用于自动化血培养的直接抗菌药物敏感性试验（AST）方案。然而，通过在自动化微生物鉴定系统中采用直接接种物制备方案，可避免对该方法依赖于质谱法进行微生物鉴定的需求。该方法可在样本采集后 24 小时内提供 AST 报告。
本研究旨在评估利用自动化微生物鉴定系统直接从呈阳性的血培养瓶中鉴定革兰阴性菌的诊断准确性，目的是将其作为欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）快速抗菌药物敏感性试验方法早期临床报告的工具。EUCAST快速药敏试验（RAST）方法于2018年首次推出，可在自动化血培养瓶报阳后4至8小时内完成抗菌药物敏感性试验结果的报告。
该方法涉及直接从已呈阳性标记的培养瓶进行 Kirby-Bauer 纸片扩散试验，并在 4、6 或 8 小时内读取结果。根据 EUCAST RAST 方法进行临床报告时，微生物鉴定是确定药敏试验结果解释类别的先决条件。实施该方法的主要挑战是在 8 小时内完成微生物的早期鉴定，尤其是在缺乏质谱仪等设备的资源有限环境中。
我们发现，直接接种方案在鉴定可报告药敏试验结果的革兰阴性菌（包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌复合体）时，准确率约为94%。这种直接鉴定革兰阴性菌的方法，比经过过夜培养后再鉴定的标准方法快约四倍。接下来，我们将重点评估这种针对革兰阴性菌败血症的临床报告方法对患者预后的影响，具体指标包括住院时长和死亡率。
此外，它还可作为一种减少抗菌药物使用以促进抗菌药物管理的工具。首先，在二级生物安全柜内，用70%异丙醇擦拭含有单一形态革兰氏阴性菌的自动化血培养瓶的隔膜。然后，用配备21号针头的无菌注射器吸取一毫升血培养液混合物。
将混合物的一大滴加至平板培养基表面。划线接种后，将培养物置于37摄氏度下培养18至24小时。在生物安全柜内观察平板上是否形成单菌落。
接下来，使用分液瓶将三毫升无菌生理盐水加入 aMIAST 管中。然后用无菌直接种针挑取三至五个形态相似的菌落。将接种物转移至第一支试管中，用生理盐水和比浊仪将菌液浊度调整至 0.47–0.63 麦氏单位。
然后将革兰氏阴性 aMIAST 鉴定卡的毛细管附件放入第一支试管中。将选定的卡片放置在卡夹上。现在将卡夹装入填充室的指定位置，使样本条形码朝内。
关闭门并按用户界面屏幕上的填充按钮。填充循环完成后，系统上的蓝色指示灯将闪烁。现在将卡盒从填充室转移至加载室。
加载完成后移除盒式废液。将试管中剩余的悬液转种至CLED琼脂平板，以检查分离物的纯度。标准接种物方案在204株测试分离株中鉴定出105株为可报告的革兰阴性菌，主要鉴定出的菌种为大肠埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和鲍曼不动杆菌复合群（Acinetobacter baumannii complex）。
首先，在二级A类生物安全柜内，用70%异丙醇擦拭含有单一形态革兰氏阴性菌的自动化血培养瓶的橡胶隔膜。然后，用配备21号针头的无菌注射器抽取5毫升血液培养液混合物。接下来，对橡胶分离管的橡胶隔膜进行消毒。
将血培养液混合物转移至离心管中，在160 ×g 条件下离心10分钟。然后在生物安全柜内小心地用移液器吸除上清液。将上清液转移至一个新的普通采血管中。
将盖好的小瓶放入离心机中，以2000 G离心10分钟。然后用无菌移液管吸除上清液。接着使用分液瓶向aMIAST管中加入3毫升无菌生理盐水。
使用无菌接种环，从冻存管底部挑取细菌沉淀物，并接种至aMIAST培养管中。使用无菌生理盐水和比浊仪将菌悬液的浊度调整至0.47–0.63之间。随后，将革兰阴性aMIAST鉴定卡的毛细管附件插入第一根试管中。
将选定的芯片正确放置在卡夹中。现在将卡夹装入填充室的指定位置，确保样本条形码朝内，关闭门，然后在用户界面屏幕上按下填充按钮。填充循环完成后，系统上的蓝色指示灯将闪烁。
现在将盒式装置从填充室转移至加载室。加载完成后，移除盒式废液。将试管中剩余的悬液转接到CLED琼脂上进行传代培养，以检查分离物的纯度。
使用直接接种法鉴定的七份阳性血培养瓶结果在该物种水平上存在分歧。通过标准接种法鉴定的105份可报告RAST的革兰阴性菌中，有98份通过直接接种法正确鉴定。在99份不可报告RAST的革兰阴性菌中，有四个阳性血培养瓶鉴定出可报告RAST的革兰阴性菌。
首先，在生物安全柜中放置两个未接种的90毫米Mueller-Hinton琼脂平板。戴上手套后，用70%异丙醇擦拭含有单一形态革兰阴性菌的自动化血培养瓶的隔膜。使用无菌注射器从血培养瓶中吸取100至150微升未稀释的血培养液。
将样品加入穆勒-欣顿琼脂平板的中心。然后使用无菌棉拭子，轻轻将菌液在平板上朝三个方向涂布均匀。接着，每个平板上放置不超过六个抗菌药物纸片。
将平板转移至35摄氏度的有氧培养箱中培养八小时。接种完成后，观察分离物的纯度。在八小时内（正负五分钟）读取抑菌圈结果。
使用短时间孵育的RAST折点表来解读结果。在aMIAST中核对细菌鉴定结果后，进行RAST方法的每周质量控制检测。
将四支无菌玻璃试管放置于试管架上。向试管中加入无菌生理盐水。随后，用无菌移液器和吸头将质控菌株从过夜培养的分离菌落转移至第一支试管中，制备0.5麦氏浊度标准的菌悬液。
从第一支试管中转移10微升悬浮液至第二支试管。混匀后，从第二支试管中转移10微升悬浮液至第三支试管，再转移至最后一支试管。接着，用无菌注射器从最后一支试管中吸取1毫升接种物。
用70%异丙醇擦拭隔膜后，将接种物转移至自动血培养瓶中。同时，使用另一支无菌针头向同一血培养瓶中加入5 mL无菌全血。将该培养瓶置于连续血培养监测系统中孵育，直至仪器提示阳性。
概述
本研究评估了使用自动化微生物鉴定系统直接从阳性血培养瓶中鉴定革兰阴性菌的诊断准确性，旨在通过欧盟抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）快速抗菌药物敏感性试验（RAST）方法促进早期临床报告。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 临床诊断
- 抗菌药物耐药性
背景
- EUCAST RAST 方法于 2018 年推出。
- 该方法可在 4 到 8 小时内报告抗菌药物敏感性试验结果。
- 该方法采用 Kirby-Bauer 纸片扩散技术。
- 微生物鉴定对于解读 AST 结果至关重要。
研究目的
- 评估从血培养中鉴定革兰阴性菌的准确性。
- 实施EUCAST RAST方法以加快临床报告速度。
- 应对在缺乏质谱技术的资源有限环境中所面临的挑战。
使用的方法
- 自动化微生物鉴定系统。
- 从阳性血培养瓶直接制备接种物。
- Kirby-Bauer 纸片扩散法。
- 在报警后四、六或八小时读取结果。
主要结果
- 展示了对革兰阴性菌鉴定的诊断准确性。
- 促进了抗菌药物敏感性的早期报告。
- 揭示了快速微生物鉴定中的挑战。
- 显示出在资源匮乏地区应用的潜力。
结论
- EUCAST RAST 方法可显著缩短药敏试验结果的报告时间。
- 微生物的早期鉴定对于有效治疗至关重要。
- 尚需进一步研究以在不同环境中优化该方法。
常见问题
行业重要性概要
加快革兰氏阴性病原体的鉴定和抗菌药物敏感性测试（AST）对于脓毒症的及时干预至关重要，尤其是在资源有限的环境中。利用自动化微生物鉴定系统实施直接接种法（DIP），可快速实现无需质谱技术的EUCAST RAST方法，将检测周转时间从数天缩短至数小时。这一能力有助于更早地基于数据制定治疗决策，并提升传染病研发整体项目的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够快速验证针对临床相关革兰氏阴性病原体的抗菌效果假设。
- 通过提供早期且准确的鉴定数据，支持微生物靶标的功能验证。
- 在进行药敏试验（AST）结果解读之前明确病原体身份，有助于降低机制研究中的风险。
筛选与检测方法开发
- 无需依赖质谱技术，即可为后续的药敏试验（AST）工作流程制备经过验证的微生物样本。
- 通过自动化鉴定和直接接种物制备，提高检测的可重复性和标准化水平。
- 通过缩短样本处理时间并减少人工干预，实现高通量筛选的快速准备。
转化与临床前研究
- 将快速微生物鉴定与传染病模型的转化生物标志物策略相结合。
- 支持从临床分离株鉴定到临床前抗菌药物敏感性试验（AST）验证的连续性研究。
- 通过提供病原体易感性的早期可操作数据，降低候选抗菌药物推进过程中的风险。
流程与工作流整合
该方法在临床分离株获取与药敏试验（AST）的接口处进行整合，架起了传染病研究领域早期发现与转化研究之间的桥梁。
- 发现生物学：提供快速、准确的鉴定，以支持基于假设的药敏试验研究。
- 筛选：提供标准化、可重复的微生物输入，用于定量药敏试验结果读取。
- 分析：生成抑菌圈直径和鉴定数据，以实现抗菌效果的稳健统计比较。
- 转化研究：通过模拟真实世界的诊断时间线，促进临床与临床前工作流程的对接。
- 企业级复用：提供可扩展、不依赖质谱技术的工作流程，适用于多种实验室环境。
运营与企业影响
- 科学价值：通过确保早期、准确的病原体鉴定，提高药敏试验（AST）结果的预测可信度。
- 操作价值：标准化并加速微生物鉴定过程，减少人工操作和周转时间。
- 战略价值：加快对抗菌候选药物的决策进程，支持资本高效的研发生命周期管理。
- 组合影响：降低后期生物学风险，支持对传染病相关资产进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备自动化微生物鉴定系统和药敏试验（AST）结果解读的专业知识。
- 需要使用经过验证的仪器设备，以及用于样本处理的生物安全基础设施。
- 要求跨团队统一接种物制备和数据解读流程的标准化操作。
- 可适用于缺乏质谱技术的环境，从而在资源有限的条件下提高检测可及性。
- 必须持续监测检测准确性和错误率，以确保临床及研发结果的可靠性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:15
Standard Inoculum Protocol (SIP) for Bacterial Identification Using an Automated Microbial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing System(aMIAST)
4:22
Direct Inoculum Protocol (DIP) for Bacterial Identification Using an Automated Microbial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing System(aMIAST)
6:52
Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Using the EUCAST Rapid Antimicrobial Sensitivity Testing (RAST)
8:00
Quality Control Testing for Rapid Antimicrobial Sensitivity Testing (RAST)
