单分子追踪显微技术——用于确定细胞质分子扩散状态的工具

3D单分子示踪技术可确定单个蛋白质的亚细胞定位及其运动行为。在活细胞中观察蛋白质的运动，能够提供其在天然环境中与结合伴侣相互作用的重要信息。本文介绍的方法为分析单分子示踪数据提供了一个通用框架，以解析生物分子的扩散状态。

该方法可应用于限制在任意形状细胞体积内的二维和三维轨迹。按照随附的文字实验方案，将荧光微珠置于预先制备好的琼脂糖垫上后，将其放置在显微镜盖玻片上，并将盖玻片固定到显微镜样品架上。随后将样品架安装到倒置荧光显微镜上。

然后启动显微镜的图形用户界面；此处使用基于 MATLAB 编写的自定义软件进行仪器控制。启动相机软件 HCImage Live。在“相机控制”部分的“采集”选项卡中，将曝光时间设置为 0.03 秒，然后点击“实时”以开始相机的实时成像。

点击图形用户界面中相应的“打开激光”按钮，以解除激光锁定并激发琼脂糖垫上的荧光微珠。使用实时成像模式在相机上观察荧光发射信号。通过点击用户界面中“微定位载物台”部分的 XY 位置箭头，调节显微镜载物台的 X 和 Y 位置，使至少一个荧光微珠位于视野中心。

如有必要，可通过点击箭头下方的下拉框来调整步长。接下来，在纳米定位台部分，点击 Z 位置箭头，调节显微镜载物台的 Z 轴位置。将荧光微球的双螺旋点扩散函数的取向设置为垂直方向。

此垂直方向被定义为Z轴校准的起始点。以起始Z位置为中心，上下各扫描30步，步长为50纳米。在每一步采集10帧图像，曝光时间为0.03秒。

要启动自动数据采集，请点击 Z 校准下方的“运行”。将一毫升热激的耶尔森氏肠炎杆菌培养物在室温下以 5,000 ×g 离心三分钟，然后移除培养物并弃去上清液。用一毫升 M2G 培养基将菌体沉淀清洗三次。

最后一次洗涤后，将沉淀的细菌重悬于 250 微升 M2G 培养基中。随后加入荧光微珠作为定位标记。荧光微珠溶液的添加量应控制在显微镜观察时每个视野中仅有 1 至 2 个微珠为宜。

通过涡旋轻轻混悬，以分离任何聚集的细胞，并将1.5 µL悬液接种至由M2G制备的1.5%至2%琼脂糖垫上，然后将琼脂糖垫倒置并放置于经臭氧清洁的显微镜盖玻片上。在显微镜物镜上滴加一滴浸油，将样品支架置于显微镜载物台上并固定。启动图形用户界面以控制显微镜的相机、样品载物台和激发激光器，然后初始化相机软件。

在相机控制部分的“捕获”选项卡中，将曝光时间设置为 0.025 秒，然后单击“实时”以开始相机的实时成像。通过点击微定位载物台部分下的 XY 位置箭头，调节显微镜载物台的 X 和 Y 位置，以扫描样品并找到细菌细胞密度适中的视野。为了最大化数据通量，盖玻片上的细胞密度应尽可能高，但需确保细胞之间不发生重叠或接触。

视野中还应至少包含一个荧光微珠，作为基准标记，以便在数据采集过程中测量载物台的位移。接下来，在“纳米定位载物台”部分，点击Z位置箭头，调节显微镜载物台的Z位置，使荧光微珠的双螺旋点扩散函数叶瓣呈垂直状态。然后进入“序列”并选择“扫描设置”。

将帧数更改为 20,000。接下来，通过点击标有三个点的按钮选择保存目标文件夹。最后，点击“开始”以 0.025 秒的短曝光时间采集最多 20,000 帧相机图像。

完成后，单击图形用户界面上相应的“关闭激光”按钮，以阻断激光照射。然后使用相同的曝光时间采集200帧暗场图像。勾选Thorlabs LED旁边的复选框，然后单击“Toggle Mirror Up”（切换镜片向上）。这将开启样品上方的LED光源，并将显微镜从荧光光路切换至相差光路。

启动数据采集软件的相差成像通道，点击“开始/停止实时显示”按钮以查看相机的实时图像。然后点击“采集并保存”以获取当前视野下细胞的相差图像。调整荧光微珠的位置，将其作为定位标记物使用。

根据文本方案中所述的模板阈值，查找并拟合所有定位点及所有相机帧。在 Easy-DHPSF 图形用户界面的“Localize DHPSF SM”部分，点击“Run”以拟合单分子信号，然后在随后弹出的窗口中点击“OK”，保留默认设置。软件将查找符合双螺旋点扩散函数特征的单分子荧光信号，并尝试使用双高斯模型对其进行拟合。

在脚本运行过程中，用户将看到原始图像数据的显示，以及成功拟合的单分子信号的重建图像。使用在 MATLAB 中编写的自定义软件，首先在弹出窗口中通过大致估计并分别在单分子定位数据和细胞轮廓中点击同一五个细胞的细胞极点，手动选择五对控制点。删除包含少于 10 个定位点的细胞，并移除部分位于视场之外的细胞，然后在弹出窗口中通过点击细胞轮廓内部删除任何其他不需要的细胞。

最后，将位于细胞轮廓边界内的定位点分配给该细胞，丢弃任何未位于细胞轮廓边界内的定位点。成功应用本方案的一个关键因素是确保单分子信号之间充分分离。

如果同一细胞中同时存在多个荧光分子，则定位信息可能被错误地分配到另一个分子的轨迹上。本方案通过剔除同一细胞内同时出现两个或以上定位点的任何轨迹，来解决轨迹连接错误的问题。因此，当单分子信号过于密集时，大量此类数据会在处理过程中被自动舍弃。

根据荧光标记融合蛋白的表达水平，每个细胞可产生约 200 至 3,000 个定位点。这些定位点可生成 10 至 150 条轨迹。需要大量轨迹才能获得采样充分的分布。

此处显示的是约 80,000 条荧光蛋白 eYFP 标记的鼠疫耶尔森菌 III 型分泌蛋白 YscQ 单分子轨迹的表观扩散系数直方图。YscQ 会结合到嵌入膜中的注射装置（injectisome），导致一部分分子（约 24%）不发生扩散，如黑色分布所示。其余的 YscQ 分子则在细胞质中自由扩散。

在本方法中，确定了游离的 YscQ 分子至少存在三种不同的扩散状态。该结论是通过将表观扩散系数的分布与已知扩散系数的模拟分布库进行拟合而得出的。在尝试分辨多种扩散状态时，应收集数千条单分子轨迹，以确保对表观扩散系数的分布进行充分采样。

可以在野生型细胞或基因敲除突变体中进行单分子示踪，以确定特定的扩散状态是否仅在分子结合伴侣存在时才出现。通过利用三维单分子示踪技术解析细胞质蛋白及蛋白复合物的扩散状态，研究人员能够确定寡聚蛋白复合物在活细胞内的形成位置、时间及机制。使用高功率激光源和操作活体人类病原体可能具有极高的危险性。

应始终遵循适当的激光安全和生物安全规程。