尿源性灵长类诱导多能干细胞的建立与维持

灵长类诱导多能干细胞（IPSCs）具有重要研究价值，但由于伦理和技术问题，通常难以获取。本方案提供了生成和维持灵长类IPSCs的最便捷途径。使用尿源细胞作为IPSCs的主要来源具有显著优势，因为这些细胞可通过完全无创的方式获得，且无需任何特殊技术。

演示该实验步骤的是来自 Wolfgang M.S. 实验室的博士研究生 Jessica Radmer。首先，将含有尿液的试管在 400G 条件下离心 10 分钟。然后小心吸除上清液，保留约 1 毫升于试管中，并用其重悬沉淀物。

加入10毫升含有两性霉素的尿液洗涤缓冲液洗涤细胞，并使用血清学移液管轻轻混匀悬浮液。离心后，小心吸除上清液，保留约少于0.2毫升液体于离心管中。将细胞沉淀重悬于1毫升含有两性霉素的初级尿液培养基中，每50毫升初始处理的尿液使用1毫升该培养基。

去除明胶，取一毫升悬浮液加入经明胶包被的12孔板中。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。为制备基底膜基质包被的12孔板，每孔加入500微升基底膜基质。

移动培养板以混匀液体，并在37摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，将基底膜基质替换为900微升REMC培养基，于37摄氏度保存备用。使用公式计算感染复数为5所需的仙台病毒体积。

将仙台病毒重编程试剂盒的各组分在37摄氏度的水浴中快速解冻。在加入计算好体积的仙台病毒并混匀前，向离心管中加入REMC培养基，总体积为100微升。按照文稿中所述方法解离尿液来源细胞后，使用细胞计数仪计数细胞，并将所需数量的细胞转移至1.5毫升离心管中。

通过离心获得沉淀，并将其重悬于100 µL预先配制的仙台病毒混合液中。将离心管在37°C孵育1小时，以进行悬浮感染。孵育结束后，在接种细胞悬液至基底膜基质包被的12孔板之前，加入REMC，使总体积达到1 mL。

转导后，每隔两天更换一次培养基，直至诱导性多能干细胞（IPSC）集落形成，并在第5天更换为PSC生成培养基。当IPSC集落生长至适合团块传代的大小时，吸除培养细胞的培养基，并用500微升DPBS小心洗涤细胞。移除DPBS后，向孔中加入500微升0.5毫摩尔EDTA，孵育2至5分钟。

在显微镜下仔细观察细胞，直至集落开始脱落。当集落边缘开始翘起且细胞之间的间隙变得可见时，移除EDTA，并小心加入500 µL的DPBS。用移液枪吸除DPBS，然后使用P-1000移液器用500 µL的PSC培养基冲洗孔板中的细胞。

用移液器上下吹打，将菌落分散成适当大小的团块。根据细胞融合度、接种细胞所需密度以及诱导多能干细胞克隆的偏好性，将细胞团悬液的1/10至1/50转移至新孔中。轻轻前后晃动培养板数次，使团块在孔内均匀分布。

将培养板在37摄氏度下孵育至少30分钟，使细胞团块贴壁。每两到三天更换一次培养基，直至克隆生长至足够传代的大小。分离后，可见随尿液排出的鳞状细胞及多种较小的圆形细胞。

可观察到首批贴壁增殖的细胞，这些细胞会生长形成较大的克隆集落，并可进行传代。可观察到两种不同的细胞类型：一种具有上皮样表型，另一种则呈现更明显的间充质样表型，形态呈细长状。首次传代后，尿源性细胞以单层形式生长。

在诱导多能干细胞（IPSC）的生成过程中，可观察到一些贴壁细胞，这些细胞开始出现形态学变化，表明细胞正在发生重编程。此外，形成克隆的细胞呈现出典型的胚胎干细胞形态。所有生成的IPSC均具有典型的类似胚胎干细胞的克隆形态，其特征为细胞排列紧密，边界清晰。

采用免疫细胞化学方法检测了猩猩诱导性多能干细胞中多能性相关标志物的表达。此外，流式细胞术分析显示，所分析的猩猩诱导性多能干细胞对TRA-1-60呈阳性。进一步地，猩猩诱导性多能干细胞能够分化为内胚层、中胚层和外胚层谱系。

分化细胞数量增加，以及克隆边缘完整性与均一性的丧失，提示诱导性多能干细胞（IPSC）质量较差。相反，边界清晰、细胞排列紧密以及核仁明显，是高质量IPSC的特征。由于存在冠状面变异，需要针对克隆特性优化相关培养条件，例如传代比例、传代时机以及细胞团块大小，以维持灵长类IPSC的健康生长。

作为已建立的诱导多能干细胞（IPSCs）的质量控制，除了检测标志基因表达外，还可以通过体外拟胚体（EV）分化等直接或间接分化诱导方法来验证其多能性。