TACI：用于三维钙成像分析的 ImageJ 插件

在钙成像记录过程中，细胞会在各个方向上移动。目前已开发出多种工具用于校正 X 和 Y 方向的运动，但 Z 轴方向的运动也需要明确诊断并进行校正。TACI 是一款用户友好的开源 ImageJ 插件。

它可检测Z轴漂移，并对各个方向存在运动的3D钙成像进行分析。制备果蝇幼虫后，用PBS清洗三次。将75微升PBS滴加到玻片中央。

取一至两条幼虫置于PBS中，将热电偶微探针放置在幼虫附近。用玻璃盖玻片覆盖幼虫和热电偶微探针，并用指甲油密封。将载玻片置于显微镜载物台上。

使用25倍物镜找到焦平面，并将热电冷却器放置在载玻片上。在共聚焦软件中，对目标荧光细胞进行调焦。调整激光功率以避免信号过饱和，并在Z轴堆栈设置中设定第一层和最后一层的位置。

同时开始Z轴层扫成像和温度记录。调节供给帕尔帖元件的电源，以改变帕尔帖表面的温度。随后，停止Z轴层扫成像和温度记录。

下载 TACI 钙成像点阵 jar 文件后，通过点击菜单栏中的“Plugins”，然后在下拉菜单中选择“Install”，将插件安装到 Fiji 中。随后重启 Fiji，并通过点击“Plugins”并选择 TACI 钙成像插件来运行该插件。选择重命名功能，以将 TIFF 文件名转换为所需的结构。

单击“浏览文件夹”以选择需要重命名TIFF图像的文件夹，并等待文件名自动填充为文件夹名称。检查最大T位置和最大Z位置。确保最大T位置和最大Z位置的参数值包含所有数字。

按顺序输入每个参数的位置。如果TIFF文件名中不包含相应短语和通道，请将对应的参数值留空，并按顺序选择NA。如果有任何后缀文本，请添加到后缀参数中。

单击“重命名”以创建一个同名文件夹，名称后跟下划线 R。注意，TIFF 文件的文件名已在文件夹中重新排列，以兼容“整理”功能。接下来，使用“整理”功能将处于相同 Z 位置的 TIFF 图像保存到同一个文件夹中。通过单击“浏览文件夹”来选择需要整理 T 图像的文件夹。

如果参数 CSV 文件存在，请等待参数值自动填充。如果参数 CSV 文件不存在，则手动填写参数值。确保相位和通道的参数值包含存在的字母，而 T 位置和 Z 位置的参数值应分别为 T 和 Z 位置的最大数值。

如果图像文件名不包含相位或通道信息，请输入 NA。需要时通过取消勾选“R 图像灰度”复选框来生成灰度 TIFF 图像。单击“组织”以创建一个同名文件夹，其名称后跟下划线、gray、下划线和 stacks，并在该文件夹中生成以相同名称命名、后跟下划线和 Z 位置编号的子文件夹。随后可观察到 TIFF 文件按 Z 位置被分类至相应文件夹中，同时会生成一个名为 param.csv 的文件，其中包含参数及其对应的值。

现在使用 Fiji 中的 TrackMate 从每个 Z 位置提取目标细胞的荧光强度。在 Fiji 中打开 Z 位置文件夹中的 TIFF 图像，通过点击插件并选择“跟踪”（Tracking），然后选择 TrackMate 来运行 TrackMate。使用 DOG 或 LOG 检测器调整参数。

调整斑点直径阈值和中值滤波参数。设置滤波器以去除无关信号。设定轨迹连接的最大距离、空缺填补的最大距离以及空缺填补的最大帧间隔。

将感兴趣区域的荧光强度导出为 CSV 文件。为每个神经元创建一个文件夹，并使用神经元编号命名，从编号为零的神经元开始。

将包含相应神经元荧光信息的 CSV 文件保存至文件夹中。将 CSV 文件命名为“mean intensity Z position number dot CSV”，文件中至少包含两列：position T 和 mean intensity，或 mean intensity channel one。创建名为 background_underscore_list dot CSV 的文件，该文件以特定格式包含所有神经元的信息，起始神经元编号为 neuron zero。

填写神经元编号，例如在第一行填写神经元零。然后提供所分析的每个 Z 位置的背景强度。如果对神经元零分析了四个 Z 位置，则在神经元零下方填写四个背景强度值。

将生成的背景列表点 CSV 文件以及包含荧光信息 CSV 文件的文件夹保存在同一文件夹中。打开 TACI，选择提取功能，然后通过点击浏览文件来选择该文件夹。

背景文件将自动填充。请填写T位置的最大数量。单击“提取”以创建结果文件夹，其中包含每个神经元的CSV文件和图表。

CSV 文件包含每个 T 位置的最大荧光强度以及 ΔF/Δ0 值。图表为 ΔF/F0 与 T 位置关系的折线图。使用合并功能，对所有神经元的 ΔF/F0 值进行平均。

计算标准误（SEM），并绘制平均 ΔF/F₀ 随 T 位置的变化图。通过点击“浏览文件”选择由提取函数创建的结果文件夹，并在相应位置填入最大的 T 位置数量。

单击“合并”以创建一个合并的数据文件夹，其中包含一个合并的带下划线的数据 CSV 文件和一张平均 ΔF/F₀ 的 PNG 图。CSV 文件包含每个 T 位置处的平均值及标准误（SEM）ΔF/F₀ 信息。该图是以 T 位置为横坐标的平均 ΔF/F₀ 折线图。

表达 GCaMP6M 的果蝇幼虫冷敏感细胞在 27 摄氏度的非激活状态下几乎不显示荧光。然而，在 10 摄氏度时，细胞内钙水平迅速升高。当温度回升时，钙水平迅速下降。

表达GCaMP六F的果蝇脑神经元在0.1时间点的钙成像显示，七个神经元中有四个呈现荧光，且这些神经元的荧光强度随时间推移而降低。在存在辛醛的情况下，多个神经元变亮。在92时间点，10个神经元的荧光同时增强，表明这些蘑菇体神经元对辛醛气味产生响应。

TACI 可以分离重叠的细胞。在此最大投影图像中，识别出两个重叠的神经元。在正交视图中，这些神经元被分离开来，表明这些神经元出现在不同的 Z 位置。

橙色细胞在Z7处显示出最强信号，而蓝色细胞在Z10处信号最强。这两个细胞荧光的变化揭示了橙色细胞存在延迟但强烈的激活。在提取过程中，神经元出现的所有Z位置中的最大荧光值被用来代表该神经元在相应层面上的强度。

若使用 TACI 分析大量神经元，需在新开发的函数中整合跨 Z 轴位置的配准，并结合荧光信息。TACI 提供了一种用户友好的开源计算方法，用于三维胶囊成像分析，可在单个细胞出现在多个 Z 轴位置时检测其在 Z 轴上的细胞运动。