使用 ImageJ 插件对细胞计数过程进行自动化定量与分析

本实验方案的总体目标是利用数字分析工具，快速准确地对悬浮液中的细胞或侵袭实验膜上迁移过程中的细胞进行计数。该方案可帮助研究人员量化常用技术及体外细胞运动能力实验所需的细胞数量。该方法的主要优势在于，能够在提供多种过滤和分析工具的同时，实现快速且准确的细胞计数。

首先，将显微镜照明调至最大。切换到 4x 物镜，并确保使用相差滤光片。然后，在显微镜软件中将图像采集设置恢复为默认值。

现在将标准血细胞计数板放置在显微镜载物台上，并拍摄一张图像用于图像体积校准步骤。根据需要调整曝光时间。在 ImageJ 软件的细胞浓度计算器中，打开该图像，然后点击“获取图像尺寸”按钮。

此操作将图像的像素分辨率填入图像宽度和高度文本框中。接下来，选择直线工具，通过单击并拖动光标，在血细胞计数板的主P方格全长上绘制一条直线。然后，按下 M 键以显示结果窗口。

现在，将长度列中的数值输入到细胞浓度计算器的 p-平方长度文本框中。然后，点击“计算图像体积”按钮，将图像体积输出至图像体积文本框。最后，点击“保存”按钮，完成插件的校准。

进行样品分析时，将10微升细胞悬液分别加入血细胞计数板的两个计数室中，并调节焦距，使细胞内部比细胞膜更暗，从而确保聚焦在细胞的中央横截面而非细胞两极。然后，进一步调整曝光，避免细胞过曝。血细胞计数板的刻度线轻微可见是可接受的。

现在，拍摄血细胞计数板中央区域五到十张无重叠的图像。每张图像的分辨率和放大倍数必须与体积校准图像一致。接下来，在细胞浓度计算器中，点击“Count Cells”（计数细胞），在弹出窗口中选择一个待计数的文件夹。

接下来，在样本数量输入框中输入每个腔室拍摄的图像数量，然后点击“确定”。插件现在将开始收集数据。更多详细信息请参见正文。首先，在显微镜软件中，将图像采集设置恢复为默认值。

对于解剖显微镜的载物台，应使用纯白色背景，并采用上方光源，最好使用两个可调节的LED灯。现在将已完成的迁移实验膜玻片放置在载物台上。观察软件显示的实时图像，手动调节放大倍数，使单个膜的边缘恰好位于相机视野范围内。

然后，调整光源位置和曝光时间，尽可能重现理想图像，即背景颜色最浅且膜面 illumination 均匀的图像。细胞计数的准确性取决于高质量的图像采集。

因此，为了最高效地使用插件，获取用户相机所能达到的最佳图像非常重要。现在，取下载玻片，并在显微镜软件中对图像进行白平衡校正，以完成校准。在成像前立即通过按压盖玻片对每张膜进行压平处理，以尽可能去除截留的气泡。

现在，在软件中设置图像保存文件夹的位置。然后，每张膜拍摄一张图像，并按照样本编号001的命名规则将图像文件保存为TIF格式，后续图像的编号依次递增。该命名规则是插件查找文件所必需的。

如果需要进行平场校正，对每张切片找到一个空白区域并拍摄一张空白图像。将文件保存为“样本名称 blank”。接下来，在 ImageJ 中打开 TC 插件。

在 TC 中，单击平场校正（Flatfield）按钮，然后在“选择目录”对话框中选择保存膜图像的文件夹。接着，打开一张迁移实验的膜图像，并选择颜色阈值（Color Threshold）。在窗口中，将方法设置为 Shanbhag。

将阈值颜色设置为白色。将颜色空间设置为 RGB，并取消勾选“暗背景”选项。接着，将上方滑块调整至 0，下方滑块调整至 255，使图像完全变为白色。

当背景变为白色后，调节绿色和红色滑块，直至仅细胞核可见。在 TC 插件中，将 RGB 滑块的数值复制到对应的配置设置 RGB 阈值文本框中。然后，点击“添加/修改”按钮，覆盖当前配置。

在配置设置面板中，单击“保存”以将设置写入硬盘。现在，要使用 TC 插件计数图像，请单击“计数文件夹”并选择要计数的文件夹。程序将处理图像，并自动将数据添加到主表格中。

现在，在主表中，如果图像因其与理想度量标准相似而被标记为需要校准，则“是否校准？”列中将出现一个对勾。请选择所有被标记为需要校准的样本。

然后，右键单击并选择“重新计数”和“建议大小”。这将使用建议的最小颗粒面积重新计数图像。接着再次右键单击，并选择“显示图表”。

理想的图像应呈现一个类似长右尾正态分布的图形。如有需要，可通过选择样本，右键单击并选择“重新计数和手动设置”来调整较小粒径范围或RGB阈值设置。然后输入所需的设置参数，单击“计数”以重新分析图像。

如需手动调整计数值，请先选择样本，右键点击表格，然后选择“使用计数值打开图像”。原始图像将随之打开，图像上带有红色标记，代表插件所计数的每个颗粒。此外，还可使用“显示已计数的二值图像”选项，以检查颜色阈值分割对单个细胞的分辨效果。

要手动添加计数，请按住控制键并单击鼠标左键。这将在光标位置添加一个标记，并计入总数。要手动移除标记，请单击鼠标右键，插件将删除距离光标最近的标记。

要移除一组标记，请选择一个感兴趣区域，然后在按住控制键的同时对该区域单击右键。细胞浓度计算器的计算过程依赖于 p-square 校准图像以及 p-square 长度与像素的计算。血细胞计数板的 p-square 体积为 100 纳升，基于这一常数，在将像素转换为毫米后，即可计算出整个图像的体积。

对来自不同实验和细胞类型的 57 张图像进行的手动计数与自动计数比较显示，两种方法之间具有高度一致性。自动计数方法能够准确检测每毫升 500 万至 2,000 个细胞的浓度。指标 Q 基于不同颗粒尺寸的分布情况，反映图像的整体清晰度。

合格的 Q 值应大于 0.5。将这些标准应用于一组在亮度和背景噪声方面从一般到优秀的图像时，校准后的图像计数值比未校准的图像计数值更接近手动计数结果。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用 CCC 和 TC ImageJ 插件，准确且高效地对悬浮细胞以及细胞运动实验中的细胞进行计数。

掌握TC插件后，可在一小时内完成细胞计数的获取、定量及调整。这两个插件均依赖于ImageJ的颗粒计数功能，并可通过编辑ImageJ所使用的宏进行修改，从而为用户提供了更大的灵活性，以便将插件的应用范围扩展至其他颗粒的分析。