监测 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬

过氧化物酶体执行β氧化反应，且易受活性氧（ROS）损伤。本方法可用于研究细胞如何应对ROS应激的过氧化物酶体。该方案不仅可用于靶向细胞群体中所有的过氧化物酶体，还可实现对单个细胞内单个过氧化物酶体的操作。

染料辅助的活性氧生成也可用于靶向过氧化物酶体以外的细胞器，以探究细胞如何应对细胞器损伤。首先，在35毫米培养皿（内含直径为20毫米的玻璃底微孔）中加入840微升培养基，分别接种2×10⁵个人源SHSY5Y细胞或6×10⁴个小鼠源NIH H3T3细胞。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。

接着，使用转染试剂或SHSY5Y细胞转染方法将目标质粒转染入细胞中。在55微升无血清的DMEM/F-12培养基中稀释质粒，在另一管中将1微升转染试剂稀释于55微升无血清的DMEM/F-12培养基中。将稀释后的DNA与稀释后的试剂混合。

轻轻混匀，并在室温下孵育30分钟。将复合物加入先前接种了100 µL含SHSY5Y细胞（不含抗生素）培养基的20毫米微孔板中。轻轻前后摇动培养皿。

按照之前所述方法进行NIH 3T3细胞转染，但在质粒稀释和转染试剂配制时，使用低血清培养基替代无血清DMEM/F-12培养基。转染2小时后，移除含有转染试剂的培养基，并加入1毫升新鲜培养基。将NIH 3T3或SH-SY5Y细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。

为了进行光激活的活性氧（ROS）生成，在转染后24小时，移除培养基，并向20毫米的玻璃微孔中加入10微升200纳摩尔的HaloTag TMR配体或200纳摩尔的Janelia Fluor 646 HaloTag配体。将培养皿转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，孵育一小时以标记细胞。一小时后，彻底移除染色液，并加入1毫升新鲜培养基。

将含有目标细胞的玻璃底培养皿置于配备载物台式培养箱的激光扫描共聚焦显微镜上。在软件中，点击工具窗口，选择目镜，然后点击DIA按钮以开启透射光。通过显微镜目镜观察培养皿，并旋转调焦旋钮使细胞清晰对焦。

选择激光扫描显微镜（LSM），然后点击染料检测选择按钮。在弹出窗口中双击所需的染料，以选择适当的激光和滤光片设置，用于对细胞进行成像。在实时成像面板中点击“Live4x”，启动快速激光扫描，开始筛查细胞的荧光信号。

使用操纵杆控制器移动载物台，找到表达中等强度 diKillerRed VKSKL 或 SLP-VKSKL 的细胞，以对过氧化物酶体施加活性氧（ROS）压力。获取目标细胞的图像后，点击工具窗口并选择 LSM 刺激功能。

然后点击椭圆按钮，在实时图像窗口中使用鼠标绘制一个直径为15微米的感兴趣区域（ROI），其中包含需要施加活性氧（ROS）应激的过氧化物酶体。为施加ROS应激，对于表达diKillerRed VKSKL或TMR标记的SLP配体的细胞，使用561纳米激光；对于经Janelia Fluor 646标记的SLP配体染色的细胞，使用640纳米激光。选择用于施加ROS应激的激光波长。

输入所需的激光百分比和持续时间。为在过氧化物酶体中产生活性氧（ROS），请点击“采集”，然后点击“刺激”按钮，分别使用561或640纳米的激光对ROI区域进行30秒的扫描刺激。该刺激对应的激光功率设置约为561和640纳米波长下的5%。

激光照射30秒后，ROI内的过氧化物酶体失去其diKillerRed VKSKL、TMR或Janelia Fluor 646信号。这种信号丢失使得能够区分细胞内被照射和未被照射的过氧化物酶体。为了监测pexophagy过程中的活细胞，可通过时间推移成像，以每10分钟为间隔，观察EGFP标记的Stub1、Hsp70、泛素、p62或LC3B向被照射或ROS应激的过氧化物酶体的转位情况。

局部光照可导致单个过氧化物酶体内部瞬时且定位的活性氧（ROS）产生，这由荧光报告分子 roGFP2-VKSKL 指示。在完成所有 roGFP2-VKSKL 测量后，拍摄了 diKillerRed VKSKL 图像，以标示受损过氧化物酶体的位置。数据还显示，未受光照的过氧化物酶体未受到影响，表明该方法具有高度精确性。

该方法用于监测Stub1介导的过氧化物酶体自噬。在此过程中，Hsp70、Stub1、泛素化蛋白以及自噬接头蛋白p62和LC3B会相继出现在受到活性氧应激的过氧化物酶体中，从而驱动过氧化物酶体自噬。利用相同的策略，可同时损伤培养皿中所有的过氧化物酶体，以进行Stub1介导的过氧化物酶体自噬的生物化学表征。

在LED照射之前，EGFP-泛素荧光在细胞质中呈均匀分布，且不与过氧化物酶体共定位。经过9小时LED照射后，EGFP-泛素信号聚集到共聚焦培养皿中细胞的所有过氧化物酶体上。通过本实验方案，我们发现受活性氧应激的过氧化物酶体通过依赖泛素的降解途径被清除。

ROS应激的过氧化物酶体招募泛素E3连接酶Stub1，从而使其可通过过氧化物酶体自噬被清除。