一种半自动化且可重复的基于生物学方法定量钙沉积的技术 体外

本方法利用人血管平滑肌细胞测定患者样本的钙化倾向，有助于推动血管钙化相关疾病的研究，并促进新疗法的开发。该技术采用基于荧光的检测方法，提高了检测灵敏度，并可实现对样本的连续时间点测量，从而减少重复实验次数，增强结果的稳健性。

首先，在未包被的细胞培养瓶中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养人血管平滑肌细胞。当细胞融合度达到70%至90%时进行传代。传代时，用PBS洗涤HVSMCs两次。

加入胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育2至5分钟。通过加入含血清的培养基终止胰蛋白酶反应。在350 × g离心力下离心细胞4分钟，并将沉淀重悬于维持培养基中。

按照上述方法制备待传代的细胞后，对细胞进行计数，并将细胞接种至48孔板中以开始钙化实验。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养后，用PBS轻轻洗涤细胞两次，第二次洗涤后小心吸除所有残留的PBS。轻柔加入钙化培养基，继续在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。

每天使用光学显微镜观察，直至出现钙化。通过成像检测钙化时，打开软件，选择“方案”和“新建”。选择“操作步骤”，然后单击“设置温度”。

在弹出窗口中将温度设置为 37 摄氏度，梯度设置为 1 摄氏度，然后单击“确定”。从下拉菜单中选择所需的板类型。单击“成像”以添加成像步骤。选择倒置成像仪，然后单击“确定”。添加三个成像通道，并将其设置为 DAPI、RFP 和明场。

勾选“拼接”框，并设置所需图像的数量和位置。调整重叠区域以更好地覆盖每个孔。选择需要成像的孔。

将打开一个新窗口，可在其中选择目标孔。单击“Focus Options”以设置对焦模式。此时将打开一个新窗口。

分别设置每个通道。通常，使用 DAPI 通道对孔板进行自动聚焦。将所有其他通道设置为“基于第一个通道的固定焦高”，然后单击“确定”关闭窗口。

通过点击“数据还原”并选择“图像预处理”来开始预设的数据还原步骤。通过选择“确定”接受默认设置。通过选择“细胞分析”来设置细胞计数步骤。从通道下拉菜单中选择TsF DAPI图像。

成像完成后设置更多细节。在弹出窗口的“Label”步骤中选择“Statistics”，以准备对RFP信号进行分析，并选择TsF RFP作为输入通道。勾选“Upper Value”和“Lower Value”选项。

在下方列表中勾选“总面积”复选框。在“颜色效果”列中选择“无”。在弹出窗口中，单击“自定义”，并勾选“背景”复选框。

点击“确定”。为获得准确的读数，通过点击左侧的“比率”按钮，将每个细胞的RFP信号进行归一化。在弹出窗口中，从下拉菜单中选择“RFP总区域定量”作为数据输入1，并选择“细胞计数”作为数据输入2。

最后，选择一个新的数据集名称，然后连续按两次“确定”。选择之前演示过的颜色效果，然后单击“确定”。在左上角选择“文件”，并将文件保存为协议文件类型。从首次出现钙化现象开始，记录每个时间点的观察结果。

在启动软件中按“立即阅读”，然后点击“现有方案”。选择上一步中创建的方案。程序将提示保存实验。

此时或之后通过单击左上方的“保存”按钮手动完成均可。弹出窗口将提示等待系统加热。打开二氧化碳气体控制器并将其设置为 5%。一旦系统达到设定温度，将出现提示，要求插入培养板并进行读数。

按“取消”。将培养板放入安全盒中，从培养箱转移至成像仪，以避免破损和溢出，并符合当地关于活细胞运输的生物安全规定，以防发生意外。将培养板放入酶标仪中。

单击“实验步骤”。在弹出窗口中，选择预设成像步骤。首先调整DAPI通道的焦距和曝光。

取消勾选所有通道的自动曝光（Auto Exposure）框，然后点击DAPI通道旁边的显微镜图标。新窗口将打开，选择孔位以调整焦点。

如果信号已可见，首先点击自动对焦，然后点击自动曝光。如果不可见，首先增加曝光时间，然后重复进行自动对焦和自动曝光。可通过选择曝光下拉菜单手动调整曝光。

检查多个孔的设置，然后保存设置。以相同方式调整所有通道的曝光。对于RFP通道，务必从一个中等至高钙化程度的孔开始。

关闭操作窗口，然后点击顶部任务栏中的绿色“立即读取”按钮。按照软件提示保存实验。对每个时间点重复此步骤。

系统读取酶标板时，所有图像将在后台自动进行处理。通过选择要显示的TsF DAPI图像来调整细胞计数的设置。通过双击选择目标孔。

新窗口将会弹出。选择其中一张图像。在弹出窗口中选择“分析”选项卡。

选择细胞分析细胞计数，然后单击“确定”。取消选中RFP和明场通道。勾选“高亮对象”复选框。单击“选项”以打开菜单。

调整大小和强度阈值，以包含所有细胞核并排除碎片，然后单击“确定”。在左下角单击“应用更改”，将设置应用于所有图像。类似地，选择一个钙化程度中等到高的井端图像。为最佳调整信噪比，请在任务菜单中单击“分析”选项卡。

选择图像统计。取消选中 DAPI 和明场通道。点击选项以打开菜单。

勾选“阈值离群值”复选框。为设置信号高于背景的非主观阈值，从任务栏中选择“线条”工具，此时将弹出一个窗口。

在信号区域划一条线，同时包含背景区域。调整阈值的上限和下限数值。仅计数高于背景的信号，若存在碎片或伪影则予以排除。

单击“确定”并应用更改，将设置应用到所有其他孔。确认其他孔中的阈值已准确选择。设置好细胞计数和RFP阈值后，导出数据。

单击下拉菜单旁边的 Excel 按钮，可将数据直接导出到电子表格中。检测并分析了从低到高不同钙化阶段。使用光学显微镜观察到钙化呈现为黑色斑点，这些斑点有助于初步评估以及确定开始成像的时机。

为了获得更高的信噪比，对处理后的RFP图像进行分析以定量钙化。数据通过在同一时间点比较两种或多种条件获得。数据经细胞数量归一化，表示为每细胞的钙化面积。

数据还以时间序列表示，展示不同时间点的相同条件。在数据降维和分析后，结果仍需反映图像转换和阈值化处理前所观察到的现象。