利用人工授粉、显微观察和S-基因型分析确定柑橘类植物的自交（不）亲和性及种间（不）亲和性关系

该技术可高效鉴定S基因型，并准确识别柑橘自交不亲和性，为选择合适的授粉树提供必要信息。这是一种省时、简便且可靠的育种亲本选择技术。该技术操作简单，初次进行实验时需要耐心和细心。

S基因型鉴定及S特异性引物设计需要更加仔细和谨慎。本实验操作由本实验室硕士研究生Yu Hu进行示范。开始采集花粉时，将马家柚（Citrus maxima）的花朵带到实验室。

用镊子采集花药并放入含有滤纸的培养皿中。将装有花药的培养皿置于28°C的烘箱中24小时，使花粉粒干燥。干燥后，将花粉保存在含有变色硅胶的Micro Centron密封自封袋中。

封好袋子，并用花粉品种名称和储存日期标记袋子。将300 µL液体培养基倒入2 mL离心管的管盖中，借助授粉刷将花粉均匀撒播。将花粉置于加湿的黑色盒子中，在28 °C条件下孵育12小时。

孵育后，用剪刀剪去1,000微升枪头顶端1毫米部分，用少量培养液吸取花粉。将花粉置于载玻片中央，盖上盖玻片。完成后，使用倒置显微镜和10倍物镜观察样品。

使用大致相同的花粉密度进行三次独立重复实验。授粉时，用授粉刷将足量有活力的花粉均匀涂抹在柱头表面，注意避免损伤雌蕊。授粉后用硫酸纸袋罩住花朵，并用回形针密封纸袋，防止基因型不同的花粉进入造成授粉。

在标签上写明物种名称以及授粉的编号和时间。将标签悬挂在授粉花朵附近的枝条上。授粉后约三至四天取下授粉袋，并用自封袋收集授粉后的花朵。

立即从花朵中去除花瓣、花托和子房，并将与花柱相连的柱头浸入含有新鲜配制的固定液的离心管中。在4°C下将柱头和花柱于固定液中孵育过夜。次日，弃去固定液，再用95%乙醇清洗柱头和花柱两到三次。

然后，向花柱中加入70%乙醇溶液，确保样品完全浸没于溶液中。此阶段的花柱可在4摄氏度条件下保存一至两个月。进行苯胺蓝染色时，用蒸馏水将保存在70%乙醇中的花柱样品洗涤三到四次。

将其浸入4摩尔的氢氧化钠溶液中，密封后在65°C水浴中孵育60分钟。在此步骤中，花柱的颜色由黄白色变为橙红色。接着，将花柱浸泡于蒸馏水中。

30分钟后，弃去蒸馏水，用蒸馏水洗涤花柱3至4次，直至花柱颜色变为黄色。然后加入苯胺蓝，使样品完全浸没，并在避光条件下孵育12小时。在荧光显微镜下观察花粉管的生长情况。

将载玻片置于平坦的桌面上。用解剖刀沿纵轴将花柱切成两半。取其中一半花柱放置在玻璃载玻片上，并在载玻片表面加入两到三滴聚乙二醇。

然后，盖上盖玻片。完成后，将玻片置于显微镜载物台上通光孔上方，使用10倍物镜进行观察。采用DAPI滤光片，观察花粉管生长情况。

观察每种授粉类型的五种方式。利用荧光显微镜定量分析了柚（Citrus maxima）的花粉活力和萌发率。相容性花粉成功在柱头表面萌发，形成正常的花粉管，花粉管继续生长并最终在子房内完成受精。

相比之下，不亲和的花粉管仅能生长通过约 2/3 的花柱长度，随后停止生长。琼脂糖凝胶电泳检测到使用 S 位点特异性引物扩增出的 DNA 产物，显示扩增的 DNA 产物片段大小在 500 至 1,000 个碱基对之间。

确定了相应的S基因型。利用该方法在不同柑橘属物种中鉴定了21种S单倍型。授粉步骤至关重要。

只有成功的授粉才能确保后续对花粉管的观察。该技术可用于分析自交不亲和性状，并探索与鉴定自交不亲和性的雌性决定因子。此方法对于自交不亲和性研究及育种项目具有重要意义。

它还可以帮助农耕社区为其果园选择授粉树。