靶向显微注射与电穿孔法对灵长类大脑类器官进行遗传修饰

我们的研究领域是灵长类动物大脑的发育与进化。我们致力于理解灵长类动物新皮质扩张背后的驱动因素。为了以切实可行且符合伦理的方式回答这一问题，我们采用脑类器官作为研究模型。

现代人类（我们）与尼安德特人之间在大脑发育上的差异 recently emerged。这些差异源于在脑发育中起关键作用的蛋白质中少数氨基酸的改变。脑类器官在这些研究中已成为至关重要的模型系统。

从进化角度研究灵长类动物的发育，并开展功能获得与功能缺失研究具有重要意义。然而，包括人类在内的类人猿天然不适合用于此类实验，因此类器官的基因改造在该领域发挥着至关重要的作用。在我实验室担任博士后期间，Michael Heide 证明了人类特有的基因 ARHGAP11B 在人类进化过程中脑容量增加方面起着关键作用。

如今，迈克尔作为德国灵长类动物中心的课题组长，通过比较人类与黑猩猩的脑类器官，提供了至关重要的见解。我们的实验方案采用特异性显微注射类脑室结构的方法，而非使用商业化的电穿孔比色皿，从而实现了靶向遗传修饰。该方法采用成本效益高的装置，包括方波电穿孔仪和培养皿电极室，无需昂贵的核效应子溶液。

虽然通过基因改造在灵长类动物中研究脑功能和脑发育在技术上是可行的，但该方法在操作上要求高、成本昂贵，且禁止用于大型类人猿。对灵长类大脑类器官进行电穿孔，为在接近灵长类脑发育的模型中引入基因改造提供了一种快速且经济高效的方法。未来，我们希望聚焦于不同灵长类物种大脑皮层中差异表达基因的鉴定与表征。

我们将通过电穿孔技术将基因导入灵长类脑类器官，研究这些基因的功能，并分析其对皮层前体细胞的潜在影响。首先，用杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco PBS 或 DPBS）洗涤培养的诱导多能干细胞（iPSCs），然后加入一毫升蛋白酶和胶原酶混合液。将培养皿置于37摄氏度环境中孵育两分钟，以使细胞脱离。

接下来，加入1.5毫升预热的iPSC培养基以终止反应。通过移液吹打7到10次，使细胞从培养皿上解离，获得单细胞悬液。将细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中。

在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞，吸除上清液。将细胞沉淀重悬于2毫升添加了50 µM Y27632的iPSC培养基中。取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。

使用添加了50微摩尔Y27632的iPSC培养基，将细胞悬液浓度调整为每150微升含9,000个细胞。为生成拟胚体（EB），在将150微升细胞悬液接种至超低吸附96孔板的每个孔之前，轻轻振荡细胞悬液管以防止细胞沉降。将拟胚体在加湿环境中培养48小时。

孵育结束后，每孔移除 100 微升培养基，并加入 150 微升预热的新鲜培养基（不含 Y27632）。将石蜡膜网格纸带纸包覆面朝上放置于 0.2 毫升离心管架上，用戴手套的手指轻轻按压每个管孔位置，在石蜡膜上形成 4 × 4 的凹穴网格，以嵌入胚状体（EBs）至基底膜基质中。随后移除纸片，并用剪刀将石蜡膜上的凹穴网格剪下，调整其大小以适配 60 毫米细胞培养皿。

将带有凹面的石蜡膜放回0.2毫升离心管架上，以作为基底膜基质液滴生成的基础。使用剪去尖端的200微升移液枪头，将拟胚体逐个从培养皿的孔中小心转移至石蜡膜的凹面内。将16个拟胚体转移至网格后，更换新的200微升移液枪头，吸除凹面中残留的培养基。

现在用移液器将一滴基底膜基质加入每个含有一个拟胚体（EB）的凹面中。取一支10微升移液枪头，迅速将EB移至每滴液滴的中央，注意不要破坏液滴边缘。将带有基底膜基质液滴的带凹面聚四氟乙烯膜置于一个60毫米的细胞培养皿中，在37摄氏度下孵育15至30分钟，使基质聚合。随后，为将包埋在基质中的EB从聚四氟乙烯膜上分离，向培养皿中加入5毫升不含维生素A的分化培养基，并用镊子将聚四氟乙烯膜方块翻转，使带有EB的一面朝向培养皿底部。

轻轻晃动培养皿，使含有胚体的基底膜基质液滴从Parafilm上脱落。如果仍有部分附着，可用镊子夹住Parafilm方块的一边，迅速向培养皿中心方向反复卷起数次。随后，将脑类器官置于37°C、含5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中，在轨道摇床上以55 rpm的速度进行培养。

将类器官置于不含维生素A的DM培养基中，并每隔一天更换一次培养基。图中显示了一个接种后第32天的人脑类器官的明场图像，其周围具有类似脑室的结构，并呈现致密健康的形态。首先为对照组和目的基因准备足量的电穿孔混合液。

将培养皿电极室连接至电穿孔仪。然后使用微量加样器吸头，将每种电穿孔混合液各8 µL注入显微注射针中。使用精细剪刀在使用前剪去针尖，以获得稳定的流速。

确保仅切去吸头尖端的一小部分，因为钝且宽的吸头会严重损伤类器官。在显微镜下挑选五个边界光滑、具有可见的类似脑室结构的脑类器官，然后用剪切过的1000微升移液器吸头将其转移至含有预热DMEM/F12培养基的35毫米细胞培养皿中。

现在小心地将针头插入类似心室结构的壁内，并注入电穿孔混合液，直至其明显充满。避免对类似心室的结构施加过大压力，以防破裂。用少量 DMEM/F12 将一个显微注射后的大脑类器官转移至培养皿电极腔中。

将类器官摆放，使显微注射后形成的类似脑室结构的表面朝向连接电穿孔仪正极的电极。现在逐个对脑类器官进行电穿孔，设置参数为每次80伏、持续50毫秒，共5次脉冲，每次间隔1秒。如果显微注射和电穿孔操作在非无菌条件下进行，则将电穿孔后的类器官转移至超净工作台内的一个新的35毫米细胞培养皿中，培养皿内应含有预热的DMEM/F12培养基。

随后，将电穿孔后的类器官置于含维生素A的培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中，以55 rpm的转速在摇床上进行培养。电穿孔后的第二天，在常规倒置荧光显微镜下观察脑类器官，以确认电穿孔是否成功。使用剪去尖端的1,000微升移液器吸头将电穿孔后的类器官转移至15毫升锥形离心管中，并吸除多余培养基。

加入足量的4%多聚甲醛（paraformaldehyde）DPBS溶液，室温孵育30分钟。孵育结束后，吸除多聚甲醛溶液。随后加入5毫升DPBS，轻轻振荡，然后吸除DPBS。

将类器官置于含有 DPBS 的环境中，于 4°C 保存以待后续使用。电转后两天，GFP 阳性细胞几乎全部定位于室管膜区，并表达 PAX6，表明这些细胞为顶端前体细胞或新生的基底前体细胞。10 天后，GFP 阳性细胞则定位于基底区域。

这些细胞还表达 PAX6 或 NeuN，分别表明其为基底前体细胞或神经元。图中展示了电转染脑类器官的三维重建，以呈现 GFP 阳性细胞在三维空间中的分布情况。