改进的脂褐质模型及高度极化人视网膜色素上皮培养中外节吞噬能力的定量分析

尽管脂褐素会随着衰老在视网膜色素上皮（RPE）中普遍积累，但其毒性作用一直难以明确。本文中，我们建立了可在高度极化且成熟的RPE培养体系中诱导类似脂褐素积累的实验方案，以帮助明确脂褐素对RPE生理功能的影响。在人体中研究脂褐素的毒性存在困难，因为当RPE细胞死亡时，脂褐素含量会随之减少。

脂褐素毒性的动物模型研究结果差异较大。我们精心构建了体外脂褐素样物质积累模型，以促进对脂褐素毒性的研究。本模型成功的关键在于维持高度分化的细胞培养状态，同时通过与体内脂褐素形成相同的过程——即吞噬感光细胞外节段——来诱导脂褐素的生成。

我们的体外实验方案具有独特性，即在高度分化的视网膜色素上皮（RPE）培养体系中，会积累类似脂褐素的物质，从而真实模拟体内视网膜色素变性（RP）的情况。在该条件下，我们发现RPE培养细胞对脂褐素的积累及其毒性作用具有高度抗性。此外，在检测RP培养模型中由类脂褐素积聚所诱导的表型过程中，我们建立了一种新型的吞噬功能检测方法，称为总消耗能力检测（total consumptive capacity）。

该实验方法使我们能够测定视网膜色素上皮（RPE）吞噬外节段的全部能力，同时避免了经典脉冲追踪吞噬实验中存在的一些混杂解释问题。我们期待利用这种类脂褐素物质积聚的模型，进一步明确哪些RPE应激因素可能使原本惰性的脂褐素转变为在RPE细胞死亡中更具病理作用的角色。首先，在生物安全柜中将聚四氟乙烯（PTFE）涂层载玻片浸入70%乙醇中10分钟以进行灭菌处理。

将载玻片置于无菌的 100 毫米细胞培养皿中自然风干。将每张载玻片放入一个新的 100 毫米细胞培养皿中，并向每个矩形区域加入 200 微升含血清的细胞培养基。然后将手持式 254 纳米紫外灯置于 100 毫米细胞培养皿上方，使灯管直接对准载玻片照射 20 分钟。

将外节（OS）的冷冻分装样品在37摄氏度水浴中解冻。随后在室温下以2,400 ×g离心5分钟。在生物安全柜中用移液器立即吸除上清液，并将OS重悬于PBS中。

现在吸去载玻片上的培养基，并在每张载玻片的矩形区域上加入最多500微升浓度为每毫升2×10⁸个OS的PBS溶液。将手持式254纳米紫外灯置于细胞培养皿上方，使灯泡直接朝向OS，照射40分钟。收集OS的PBS溶液至1.5毫升离心管中。

用 200 至 500 微升 PBS 清洗包被载玻片的矩形区域，并将每次洗涤液收集至微量离心管中。然后，在室温下以 2,400 ×g 离心 5 分钟，沉淀 OS PBS 溶液。在生物安全柜中用移液器吸除 PBS，将沉淀重悬于 500 微升标准培养基中，用于视网膜色素上皮（RPE）培养。

取10微升悬浮液置于新的微量离心管中。用更多细胞培养基稀释50至100倍，并使用血细胞计数板对OS进行计数。稀释光氧化的OS或OXOS悬浮液。

将浓度为每毫升 5.6 × 10⁷ 个外节段（OS）加入标准 RPE 培养基中。加入促进外节段摄取和脂褐素积累的吞噬作用桥接配体。然后将氧化的外节段（OXOS）分装至一次性冻存管中，并在液氮中速冻。

通过将冷冻的OXOS分装样品稀释于45微升细胞培养基中，解冻后加入至RPE transwell中，以诱导脂褐素的积累。随后，使用共聚焦显微镜进行λ扫描，测定OXOS的发射光谱，以表征氧化后的外节（OS）。共聚焦成像显示，经处理的OS相比未处理的OS自体荧光增强。首先，取已固定的、含有脂褐素负载的RPE培养物的transwell。

用 PBS 清洗培养物五次后，在顶端室中保留少量 PBS。将 transwell 倒置置于解剖显微镜下。使用刀片，在半透膜与 transwell 的连接处施加切割力，将半透膜从 transwell 上切下。

用镊子将跨孔膜剪下后，将其放置在显微镜载玻片上。用擦拭纸擦去多余的 PBS，注意避免触碰细胞。加入封片剂，随后盖上盖玻片。

务必注意记录Transwell小室的哪一侧朝上。接下来，使用激发峰约为488纳米、发射检测波长为500至530纳米的荧光染料检测目标抗原。另设一个通道，采用405纳米激发、585至635纳米发射进行自发荧光检测。

与5次喂养相比，OXOS诱导的自体荧光颗粒在20次喂养后表现出更多的积累。比率计量成像有助于将UAM的自体荧光与Alexa 488标记的LC3区分开来。红色通道仅包含不可消化的自体荧光物质，有助于将LC3信号从绿色通道中分离出来。

首先，计算实验所需的孔数，然后解冻适量的常规外节（OS）样品。加入足够的RPE培养基，使外节的终浓度达到每毫升4×10⁶。移除顶端培养基，每孔加入50微升浓度为每毫升4×10⁶并含有适当浓度桥联配体的外节溶液。

加入OS后，将样品在不同时间点进行孵育。孵育结束后，加入16.67微升含有蛋白酶抑制剂的4倍Laemmli上样缓冲液，以裂解细胞及上层含OS的上清液。使用P200移液器刮取Transwell膜表面，并将细胞上清液与细胞裂解液合并收集。

涡旋混匀后室温放置30分钟，以确保充分变性。视紫红质的蛋白质印迹结果显示，对照组与含UAM的RPE细胞中完整视紫红质条带无明显差异。然而，UAM组中视紫红质的裂解产物较多，提示吞噬溶酶体系统可能存在轻度降解功能障碍。

GAPDH 水平相等表明各孔之间的细胞数量相同。不同的视紫红质抗体可识别不同的降解片段。4D2 识别视紫红质的末端，该末端在溶酶体降解的最后步骤之前始终保持完整。

相比之下，1D4 抗体识别视紫红质的C末端，该区域在吞噬溶酶体过程中更早被降解。