通过质粒显微注射分析极化上皮细胞中小GTP酶的功能

该实验用于检测小分子GTP酶对极化膜运输的影响。首先，将编码小分子GTP酶和报告蛋白的DNA质粒共注射到极化细胞的细胞核中。随后，在特定温度下表达DNA，使报告蛋白滞留在内质网或反式高尔基体网络（TGN），同时小分子GTP酶在细胞质中积累；接着，在环己酰亚胺存在下，追踪报告蛋白向细胞表面的运输，以阻止新的蛋白质合成。

最后，对细胞表面的报告蛋白进行标记，以进行免疫荧光分析。通过该实验获得的结果可用于共聚焦显微镜下观察表面定位的变化。该技术相较于现有方法（如转染）的主要优势在于，通过显微注射实现的短时间过表达可将继发效应降至最低，从而允许我们研究目标蛋白的初级效应。

该方法有助于解答细胞极性研究领域中的关键问题，例如小GTP酶如何调控极化的膜运输过程。由于成功进行显微注射所需的各个步骤难以仅通过文字描述清楚，因此本方法的可视化演示至关重要。根据生产商的说明书，使用Sigma Aldrich内毒素去除型大提试剂盒分离无内毒素的质粒DNA。本实验中，使用三个透明的12毫米Transwell滤膜，孔径为0.4微米，用于细胞培养。

将四乘以十的五次方个MDCK细胞接种到每个滤膜上。两天后，在显微镜下观察培养物，以确认细胞正在形成闭合的单层。用于显微注射。

显微注射当天，准备直径360毫米、高15毫米的培养皿，内含5升MM生长培养基及15毫摩尔的heis，置于39摄氏度培养箱中。此外，准备3块12孔板，每孔加入1毫升MEM生长培养基，含50毫摩尔heis和0.1毫克/毫升环己酰亚胺，并将12孔板置于31摄氏度培养箱中。打开显微注射显微镜，配置为倒置显微镜，载物台加热，配备10倍和32倍物镜，以及einor femto jet系统。

将加热载物台设置为 39 摄氏度。同时打开氮气罐对隔振台的供气。现在用过滤水稀释 DNA，使其最终浓度为 0.2 毫克/毫升。

随后，在微型离心机中以 13,000 RPM 离心 DNA 30 分钟。移除上清液，并将沉淀转移至新管中。接下来，用手术刀将滤膜从培养皿中取出，从滤膜支架上剪下滤膜，放入已准备好的 60 × 15 毫米培养皿中，该培养皿含有 5 毫升预热至 39 °C 的 MEM 生长培养基，另加 50 毫摩尔 HEPES。

为了压住培养皿中的滤膜，将手术刀片置于滤膜中央，然后将培养皿转移到显微镜的加热台上。吸取 2 至 3 微升稀释后的 DNA 溶液至显微注射针中。旋转针头的保护盖，使其脱落并掉落到地面。

将针头安装到针座时，按下注射器的菜单键，并确保阀门已关闭。将针头旋入针座中，注意不要将针头拧得过紧。

由于这可能导致损坏，请再次按下菜单键。这样施加的补偿压力将在显微注射过程中防止培养基被吸入针尖。最后，轻触操纵杆以清除存储的归位位置，使针头下降至细胞表面。

使用10倍物镜，将针头移至液面上方的光束中。然后对细胞进行聚焦。再将聚焦旋钮向上旋转180度，重新向上聚焦，找到针头。

缓慢移动针头使其进入焦点，然后再次将其移出焦点。继续操作，使细胞重新进入焦点。

将针头再次向下调节至对焦。重复此操作，直至针头接触培养基表面，此时可观察到光晕现象。继续调节至细胞清晰对焦，而针头仍处于焦平面外模糊状态。

现在切换到 32 倍物镜并找到粗调设置。通过用针尖接触顶膜并减去约 10 微米来设定 Z 轴限位，因为细胞核位于顶膜下方约 10 微米处。

现在尽快将针头从焦平面移出几微米。将针头对准细胞核上方，按下并释放操纵杆上的注射按钮。起始压力设为 95 PSI，以确定合适的注射压力。

如果压力过高，细胞会破裂；如果压力过低，则会出现一个持续存在的白点，但无其他变化。在不改变细胞大小的情况下，完成一次涉及相变的成功注射。

在位于细胞上方的手术刀片孔洞内注入100至500个细胞。然后将含有细胞的培养皿和手术刀片放入39摄氏度的培养箱中，孵育2小时。最后，将细胞转移至预先准备好的12孔板中，每孔加入1毫升MEM培养基，其中含有50毫摩尔、0.1毫克/毫升的环孢素，并在31摄氏度下孵育2小时。

为避免表达的GFP信号发生漂白，在后续所有表面染色步骤中，需用铝箔覆盖样品以避光。将细胞置于培养皿中，放在冰上的金属板上并进行洗涤。用冰冷的PBS plus plus洗涤一次后，将一块洁净的帕拉膜置于冰上的金属板上，用移液器滴加30 µL能够识别目标蛋白胞外域的抗体溶液。

现在将含有细胞的滤膜倒置放在液滴上，并在滤膜背面加入数滴抗体。冰上孵育一小时。用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后在室温下用3%多聚甲醛固定15分钟。

用含钙镁的 PBS 缓冲液洗涤细胞一次，再用含钙镁的 PBS 缓冲液平衡 5 分钟。随后将细胞置于封闭透化缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。用封闭透化缓冲液（BPB）以 1:200 的比例稀释一抗，用于检测表达的 RAB GTP 酶。在 13,000 转/分钟的条件下离心 10 分钟，然后用移液器吸取 30 微升抗体溶液，滴加到置于湿盒中的洁净载玻片上。

将细胞倒置放置在滤膜上的抗体液滴中，室温孵育一小时。孵育完成后，将细胞翻转至正面朝上，放入12孔板中，在室温下用BPB洗涤五次，每次间隔6分钟，共30分钟，期间包含适当的二抗孵育及洗涤步骤。

将滤膜上的细胞在去离子水中浸洗三次，然后正面朝上置于载玻片上，加入10微升封片液。取一块18×18毫米的盖玻片覆盖其上，用面巾纸轻轻按压盖玻片，使其紧贴细胞。最后用指甲油封片。在仅转染编码V-S-V-G-T-S-O 45 GFP质粒的模拟转染实验中，该蛋白被递送至极化良好的MDCK细胞的基底外侧膜，这一点可通过非极化良好细胞中红色表面染色结果进行判断。

部分GFP融合蛋白会被运送至顶膜。如果对照样本呈现此现象，则数据不可信，应使用极性更好的细胞重复实验。请注意，在31摄氏度的追踪过程中，并非所有表达的GFP融合蛋白都会被运送至基底外侧膜，这由细胞内广泛的绿色荧光信号（代表总蛋白）所证实。掌握该技术后，自实验开始起大约需要10至12小时完成。

该技术为膜运输领域的研究人员探索极化上皮细胞中的调控蛋白铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何利用显微注射技术在极化上皮细胞中表达蛋白。