由等离激元DNA折纸纳米天线实现的单分子表面增强拉曼散射测量

我们的研究旨在开发新的工具，通过表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering，简称SERS）来检测单个分子。这是唯一一种能够提供分子化学指纹信息，并且灵敏度足以检测单个分子的技术。通过这种方法，可以获得关于化学反应的详细机理信息。

DNA折纸纳米结构已被用于精确定位等离激元纳米颗粒和靶分子。这是必要的，因为增强的拉曼散射源自纳米颗粒之间微小的纳米级体积区域，我们称之为“热点”。为此，我们现已开发出新型的等离激元DNA折纸纳米天线。

主要挑战在于将目标分子置于两个纳米颗粒之间的这些热点区域，并且仅从一个纳米天线结构中采集拉曼信号。为了获取大量数据，需要高效地关联原子力显微镜与拉曼光谱的结果。等离激元DNA折纸纳米天线可实现大量等离激元二聚体的可重复制备，其中目标分子被精确定位于纳米颗粒之间的热点区域。

通过关联原子力显微镜（AFM）与拉曼数据，我们现在能够确认所检测到的仅为单个分子。如今，我们可以实时追踪诸如染料分子或蛋白质等单个分子，观察它们在热点区域的行为以及对环境化学变化的响应。例如，最近已实现了对单个稀土分子自旋态变化的监测。

未来，我们的目标是在单分子水平上监测化学反应，并研究其反应机理。此外，我们还可以利用该技术以极高的灵敏度检测具有医学意义的生物分子。为在单一体系中实现DNA折纸结构的自组装，首先在TAE缓冲液中配制混合液，其中包含2.5 nmol的环状支架链M13、MP18以及100 nmol的201条短多边形核酸 staple 链，并添加15 mmol的氯化镁。

然后用超纯水将溶液总体积调至100 µL。在PCR仪中使用温度梯度对溶液进行退火处理。首先迅速加热至80 °C，然后按照显示的温度梯度程序逐步进行。

为去除混合物中过量的短链DNA，将100微升DNA折纸溶液加入截留分子量为100千道尔顿的超滤离心管中，随后加入400微升超纯水。然后在室温下以6,000 ×g离心8分钟。离心后，取下滤膜并将离心管倒置以弃去滤液，再向滤膜中加入400微升超纯水，并按前述方法再次离心。

为收集纯化的纳米结构溶液，将滤芯在新离心管中倒置，按照制造商说明书在室温下以1000 ×g离心两分钟。使用原子力显微镜（AFM）成像确认DNA折纸叉形结构的正确组装。正如预期，大多数叉形结构完整，无断裂臂。

然而，由于连接臂的直径较小且柔韧性高，难以对其进行成像。为了用DNA包被金纳米颗粒，取400微升市售的金纳米颗粒溶液，在3,500 × g离心力和室温条件下离心5分钟。使用移液器去除上清液，并将沉淀物重新溶解于25微升超纯水中。

接下来，加入4 µL市售的100 µM巯基修饰DNA。加入1 µL 100 mM TCEP溶液。将混合物在室温下孵育10分钟。

孵育后，取五微升混合物加入先前浓缩的金纳米颗粒溶液中。将所得混合物涡旋振荡五秒钟，并在零下20摄氏度下冷冻至少两小时。待冷冻混合物在室温下解冻后，在室温下以3,500 ×g离心五分钟，以去除过量的添加DNA包被。

使用移液器去除上清液，并将沉淀物重悬于 10 µL 水中。每一步骤中溶液颜色的变化表明金纳米颗粒包被成功。一旦加入 DNA，金纳米颗粒的深红色即变为深紫红色。

冷冻使颜色变为紫色，而解冻后则恢复为深红色。60 纳米 DNA 包被的金纳米颗粒的吸收光谱相较于未包被的金纳米颗粒显示出吸收峰的偏移。为了组装 DNA 折纸纳米天线（DONAs），需使用 DNA 包被的金纳米颗粒以及预先组装好的 DNA 折纸叉结构。

将纳米叉溶液加入包被的金纳米颗粒溶液中，保持最终摩尔浓度比为1.5:1。向混合物中加入50毫摩尔储备液的氯化镁，使氯化镁的最终浓度达到4毫摩尔。使用超纯水将最终体积调至20微升。

使用PCR仪中的温度梯度对DONA进行杂交。首先快速加热至40摄氏度，然后逐步按照显示的温度梯度程序进行操作。为纯化DONA，通过将0.8克琼脂糖溶解于80毫升TAE缓冲液中制备1%琼脂糖凝胶，该缓冲液需添加5毫摩尔的氯化镁。

向18微升的DONA溶液中加入2.25微升含有30%甘油和13毫摩尔氯化镁的上样缓冲液。将凝胶置于冰水浴中，以70伏电压电泳60分钟。切下目标条带，置于用石蜡包裹膜包裹的显微镜载玻片上。

然后使用另一张包裹有石蜡膜的显微镜载玻片挤出溶液。用移液器将挤出的液体收集到一个 500 微升的离心管中。在琼脂糖凝胶纯化过程中，出现了一条对应于 DONA 的二聚体条带，位于游离金纳米颗粒条带的上方，后者是样品中迁移速度最快的条带。

为对纯化的DNA折纸纳米天线（DONA）进行共定位的原子力显微镜成像和拉曼测量，首先将硅芯片用等离子体处理10分钟。在芯片上加入10微升纯化的DONA溶液和10微升100毫摩尔/升氯化镁溶液，孵育3小时。随后用乙醇-水混合液清洗芯片两次，并用压缩空气吹干。

将干燥的芯片粘贴在磁盘上，并将其插入原子力显微镜（AFM）仪器中进行成像。接下来，选择拉曼测量所需的激光波长、功率和累积时间。对于完全包被Tamra的金纳米颗粒，应选择633纳米激光，功率为100微瓦。

积分时间为1秒。进行单次Tamra测量时，将功率调整为400微瓦，积分时间为4秒。

调整参数后，将光标置于AFM图像中目标DONA的上方，然后开始拉曼测量。对于共定位测量，需先对样品进行AFM成像以定位DONA。

随后，采集并比较了单个 DONA 的拉曼光谱，以确认所获得的光谱来自 Tamra 分子；在完全包被 Tamra 的金纳米颗粒中，主要的 Tamra 特征峰可见。尽管单分子 Tamra 光谱的信噪比较低，但其主要特征峰仍可识别。