利用电子束光刻制备的纳米结构基底通过表面增强拉曼光谱检测生物分子

以下实验的总体目标是构建并表征共轭纳米生物系统，该系统通过将固体纳米结构基底与固定化的生物分子相连接而形成界面。该目标通过采用超高分辨率电子束光刻技术（EBL），在熔融石英基底上制备出微小的金属纳米结构阵列来实现。第二步，将基底置于溶液中，使生物分子在其表面固定化，从而形成纳米生物界面。

接下来，采用表面增强拉曼光谱（SERS）来探测界面处的生物分子。所获得的SERS光谱呈现出特定分子的拉曼振动模式特征，其信号强度强烈依赖于基底的设计。与现有技术（如红外光谱）相比，本方法的主要优势在于，由于金属纳米结构中的表面等离子体共振效应，检测灵敏度可得到显著提升。

我们的方法通过分子功能化与电子束光刻技术的结合，能够创建出高度选择性的表面，并实现便捷调控。该方法可回答多个领域的关键科学问题，涵盖结构生物学探索研究、聚合物驱动的服务应用，以及涉及纳米生物界面的各种器件开发。该方法能够深入揭示生物分子的结构特性，其影响可延伸至医学诊断或环境检测等领域。

通常，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为该方法涉及纳米制造、表面功能化、生物化学和光谱学等多个传统上互不相关的领域。首先，在基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）抗蚀剂层和导电层。为此，使用带有真空卡盘的晶圆旋转涂布仪，将样品逐一置于卡盘中央。用玻璃移液管在样品中心滴加一滴 PMMA 抗蚀剂。

然后以3,500 RPM转速离心60秒，加速度时间为2秒。接着将基底在180摄氏度下烘烤3至5分钟，烘烤完成后使样品随基底冷却至室温，随后将基底放回旋涂机卡盘。在基底上滴加一滴导电聚合物。

按照文本方案中所述，在完成电子束光刻（EBL）曝光后，将样品在80摄氏度下烘烤一分钟，然后以3000 RPM转速旋转基底40秒，随后进行两秒的斜坡减速。准备一个烧杯，装入去离子水以去除导电聚合物。再准备第二个烧杯，加入显影液混合物，室温下搅拌五分钟。

最后，使用镊子在第三个烧杯中准备好异丙醇作为冲洗剂。将样品放入水中3秒，以去除导电聚合物薄膜。然后将样品放入显影液中，并立即缓慢上下移动镊子20秒，随后迅速将基底转移至异丙醇中，再冲洗10秒，接着用氮气吹干样品。将样品倒置装入电子束蒸发系统中，以便蒸发的金属沉积在样品的正面。

在第一和第三种设计的样品上沉积一层约10纳米厚的金层，在第二种设计上沉积一层约10纳米厚的银层，沉积速率为每秒约0.1纳米。然后，向超声系统中加入推荐高度的水，并在另一个烧杯中倒入丙酮。

将样品正面朝上放入烧杯底部，保持烧杯静置，使样品浸泡10分钟。然后将烧杯放入水浴中，调节丙酮液面高度与水位高度一致。随后开启超声系统。

超声处理最长持续60秒。为首先制备设计一的样品，先在室温下配制1毫摩尔的MUA与乙醇溶液，并超声处理10分钟。将合适的纳米结构基底浸入MUA溶液中，浸泡48小时。

然后用乙醇冲洗样品三次，并干燥五分钟。将温度调至室温。接下来，用EDC和蒸馏水配制75毫摩尔的溶液。

同时，使用微量移液器将 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）配制成 15 毫摩尔的水溶液，取 100 微升 NHS 溶液滴加到基底的金表面，随后立即在同一区域加入 100 微升 EDC 溶液。孵育 1 分钟，以活化 MUA 的自组装单分子层。然后，在基底的同一区域滴加 100 微升蛋白质溶液。

将样品放入培养皿的一个区域中，另一区域加入一毫升蒸馏水。用盖子密封培养皿，并在5°C条件下保存样品24小时。随后，将样品在蒸馏水中清洗三次，每次分别置于不同的烧杯中持续清洗20秒；清洗过程中或清洗后均不得使样品干燥，针对设计中的两个样品均需如此操作。

在磷酸钾缓冲液中配制0.9毫摩尔的葡萄糖结合蛋白（GBP）溶液。同时在缓冲液中配制100毫摩尔的DG葡萄糖溶液。接下来，取30微升D-葡萄糖溶液与30微升GBP溶液混合。

使用一个1毫升的塑料微量离心管和微量移液器孵育30分钟，然后将20微升无配体的GBP溶液和20微升配体结合的GBP溶液分别滴加到制备好的基底上。使用微量移液器将样品置于培养皿中，加盖密封后于5°C保存24小时。在室温下用磷酸钾缓冲液冲洗样品三次以进行准备。

设计三个样品，将多巴胺结合适配体（DBA）溶液用终pH为7.4的Tris-EDTA缓冲液稀释至1微摩尔浓度。使用分析天平称量多巴胺粉末，并将其溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入搅拌子搅拌5分钟，配制成5微摩尔浓度的多巴胺溶液。然后，将20微升DBA溶液滴加至各基底表面，将样品置于培养皿中，室温下避光孵育1小时。

用磷酸钾缓冲液将样品冲洗三次后，将样品垂直放置在洁净室级别的擦拭纸上，以干燥基底背面，同时保持基底正面的液膜。留出一份样品作为对照。随后，将 5 µL 多巴胺溶液滴加到现有 PBS 表面。

将剩余样品点样。在磷酸钾缓冲液中清洗样品三次前，先将样品孵育10分钟。以进行拉曼光谱分析。

将每个样本置于防水腔室中，以避免激光照射导致蒸发。用化学惰性的高真空润滑脂填充塑料注射器。然后将样本放置在玻璃载片上，并在不接触样本的情况下，在其周围挤出数毫米的润滑脂。

将显微镜盖玻片置于基底上方，轻轻按压以形成密封，使基底与盖玻片之间形成一层薄的液体界面，同时避免缓冲液接触真空油脂。使用光学拉曼显微镜系统，在不开启激光的情况下，对准待测金属纳米结构区域的表面进行聚焦。

按照文中所示实验方案进行拉曼采样。此处为在熔融石英上制备的金和银-镍纳米图案点阵列。采用电子束光刻（EBL）可实现优异的位置和尺寸控制。

控制点的尺寸和间隙宽度由电子束光刻（EBL）曝光控制。此处展示的是金和银-镍复合材料的六边形阵列。此类超薄金属层的成核行为导致形成不连续结构。

在此系列光谱中，设计一中固定在基底上的蛋白A信号强度来自阵列一的信号远强于阵列二，阵列三的信号则非常微弱。间隙间距显然是影响等离子体去耦合以及拉曼散射表面增强效果的关键参数。

以下是葡萄糖结合蛋白的光谱图，展示了不同底物设计在配体游离态和配体结合态下的影响。最后给出了多巴胺结合适体在配体游离态和配体结合态分子的光谱图。为作参考，还显示了多巴胺粉末的光谱图。

在进行该实验操作时，重要的是避免基底材料被污染。由于光谱技术具有高度敏感性，若操作不当可能会导致错误的读数。可针对特定分析物确定最佳的源基底设计。

随后，可以采用其他非光刻图案化方法（如非印刷型PHY），以进一步提高基底制备的可扩展性。该技术帮助生物化学与生物传感领域的研究人员能够在溶液中无需特定表面的情况下，检测极微量的生物分子。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用制备技术调控金属纳米结构的尺寸与薄膜特性，以及如何运用不同的生物分子识别策略来靶向不同的分析物。