单分子蛋白质研究中的表面钝化

本实验的总体目标是获得高质量的官能化石英载玻片表面。首先使用水和丙酮清洗带孔的石英载玻片和盖玻片，然后利用氢氧化钾和piranha溶液对载玻片进行蚀刻，以提升表面质量。

接下来，将载玻片和盖玻片用氨基进行功能化处理，随后使用聚合物对表面进行两轮处理，使玻璃表面呈惰性。最后一步是将载玻片和盖玻片组装成微流控腔室，使聚乙二醇（PEG）包被或经PEG修饰的表面相对放置。最终，通过两轮PEG分子处理表面的新策略显著提高了钝化质量，这一点在单分子荧光显微镜观察中得到了证实。

该技术相较于现有技术（例如氧化钾刻蚀后进行聚合物涂层）的主要优势在于能够确保更优异的质量。由于需要进行多种表面处理，初学者在使用该方法时可能会遇到困难。开始操作前，请参照文本方案中详细说明的步骤处理石英载片。

将载玻片放入玻璃染色缸中进行清洗。通常每个染色缸可放置5至15张载玻片。用超纯水冲洗载玻片，重复冲洗三次，随后用超纯水超声处理5分钟以去除污物，弃去水后，再用超纯水额外冲洗三次。

接下来，将超纯水替换为丙酮，并用丙酮超声处理载玻片20分钟或更长时间，弃去丙酮，再用Milli-Q水冲洗载玻片以去除任何残留的丙酮。随后，将水替换为1摩尔的氢氧化钾溶液，并超声处理载玻片20分钟或更长时间。过度刻蚀会提高表面质量，但可能引入划痕，从而干扰荧光成像。

用 Milli Q 水冲洗载玻片三次，以去除残留的氢氧化钾，从而进行 piranha 刻蚀。将载玻片转移至 Duran 载玻片架或定制的聚四氟乙烯（Teflon）架中，并将其放入位于通风橱内的 1 升烧杯中。向烧杯中加入 450 毫升硫酸。

然后加入150毫升过氧化氢，使硫酸与过氧化氢的体积比为3:1。搅拌溶液以充分混合，并将烧杯静置20分钟。将载玻片从piranha溶液中取出，放入盛有去离子水的载玻片架中。

与此同时，将piranha溶液弃入指定的废液瓶中。待其冷却至室温后，在盖玻片清洗后用UE水冲洗载玻片三次。将染色缸中的UE水替换为甲醇。将载玻片和盖玻片保存在甲醇中。

同时，通过将100毫升甲醇倒入烧瓶中来配制氨基硅烷化溶液。然后加入5毫升冰醋酸和3毫升3-氨基丙基三甲氧基硅烷，轻轻振荡混匀。将盛有载玻片和盖玻片的染色缸中的甲醇替换为氨基硅烷化反应混合液。

孵育20至30分钟，在孵育期间超声处理一次，每次1分钟。接着用甲醇替换氨基硅烷化反应液，然后弃去甲醇并加入新鲜的甲醇溶液。

对第一轮表面处理重复此步骤三次。首先使用聚合物，用氮气将载玻片和盖玻片吹干。然后将其放入部分装有超纯水的洁净移液管盒中，确保需要进行聚乙二醇化的面朝上。接着，将64 µL新鲜配制的反应缓冲液加入已准备好的聚乙二醇溶液中。

用移液器上下吹打混合物，以确保完全溶解。然后在16,100 G条件下离心1分钟。为去除气泡，将70微升的聚乙二醇化混合物滴加到干燥的石英载片上。

将干燥的盖玻片轻轻放置在溶液上，将载玻片置于黑暗且湿润的环境中孵育两小时至过夜，以保存经聚乙二醇修饰的载玻片和盖玻片。通过将盖玻片水平滑动移开，小心拆卸载玻片和盖玻片，并用超纯水冲洗，随后用氮气干燥。将一对载玻片和盖玻片放入50毫升离心管中，使聚乙二醇修饰的表面彼此背向放置。

将管子部分关闭，在充入氮气前进行抽真空，然后拧紧管盖。于-20摄氏度保存。这些步骤有助于长期保持聚乙二醇化表面的稳定性。

在使用载玻片组装微流控腔室之前，立即按照文本方案中所述进行第二轮聚乙二醇修饰。将石英载玻片放置于平坦表面上，使经聚乙二醇修饰的一侧朝上。通过在载玻片上贴上双面胶带，在修饰表面上对角方向形成一个通道。

确保孔洞位于通道的中央。然后将聚乙二醇化盖玻片轻轻放置在上方，以完成腔室的组装，注意聚乙二醇化面朝下。

通过将盖玻片压在双面胶带所在区域来密封样品室。操作时应轻柔但彻底，确保样品室完全密封且不漏水。最后，用环氧树脂胶封闭样品室的边缘。

继续固定链霉亲和素或中性亲和素，并加入生物素标记的生物分子用于单分子成像，具体操作如文本方案所述。如果表面修饰成功，则在每个成像区域观察到的非特异性吸附蛋白少于10个。当向样品池中加入1至10纳摩尔的荧光标记蛋白时，若任一清洗或反应步骤未正确执行，非特异性吸附蛋白的数量将显著增加。例如，若跳过piranha刻蚀步骤，观察到的非特异性吸附将增加100倍。

双聚乙二醇化的优越性在此处得到显著体现。如左图所示，采用双聚乙二醇化时，来自荧光分子和溶液的背景信号明显更弱。这表明蛋白质被双聚乙二醇化层排斥得更为有效。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。切勿忘记，操作 AYA 时可能极为危险，因此执行此操作时必须始终采取适当的预防措施，如佩戴合适的手套、护目镜和围裙。