利用功能性定点荧光测定法在原代细胞中研究骨骼肌兴奋性

Kv1.1 是电压门控离子通道家族的一个成员，具有四个不同的电压感受器。有证据表明，某些电压感受器对雷诺丁受体激活或钙电流的贡献更大。我们的目标是能够明确识别每个电压感受器在兴奋、收缩耦联以及钙通道激活中的具体作用。

自20世纪50年代初以来，兴奋-收缩耦联一直被研究，但该过程发生的分子机制至今仍不明确。近年来，通道蛋白的冷冻电镜结构取得进展，新型Kv1.1辅助蛋白得到表征，通道的选择性剪接变体被发现，致病突变也被鉴定，这些进展重新激发了人们对这一领域的兴趣。本领域使用多种技术，从经典电生理学和分子生物学，到更前沿的技术，如冷冻电子显微镜、分子动力学模拟、靶向蛋白质降解、功能位点导向荧光测定法，以及工程化细胞或动物模型的构建。

目前，该领域面临若干实验挑战。在骨骼肌中，Kv1.1 与 RYR1 之间以及多种调节蛋白之间的正确转运和通信对于支持兴奋-收缩耦联至关重要。然而，目前尚缺乏或尚未完善用于直接研究 Kv1.1 与 RYR1 之间这些蛋白质-蛋白质相互作用的方法。

马丁·施耐德博士的实验室数十年来一直致力于兴奋-收缩耦联的研究，致力于表征Kv1.1中的电压感应机制、钙释放以及定位于钙释放事件（即钙火花）的过程。最近，我们的实验室开始采用新的光学技术，以研究兴奋-收缩耦联的各个步骤以及功能性成年肌细胞中电压传感器的运动。尽管此前已在异源表达系统中实现过类似研究，但我们的新方案现在能够在天然环境中追踪传播的动作电位期间Kv1.1电压传感器的构象变化。

我们的新技术将使我们能够研究兴奋-收缩耦联所需的电压感受器的精确运动。我们希望了解每个S4中的哪个电荷残基对其功能至关重要，或者每个S4如何发生易位，以及所有这些易位过程是如何与Kv1.1通道的开放或雷阿诺丁受体的激活相关联的。首先，构建一个野生型、荧光标记的CaV1.1 cDNA质粒。

此处使用一种质粒，用于表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的兔源Cav1.1钙通道α亚基。该质粒含有巨细胞病毒（CMV）启动子，可在肌纤维中实现高效的转染。利用 commercially available site-directed mutagenesis kit（商品化定点突变试剂盒）在待检测的通道蛋白中引入半胱氨酸替换，以便通过荧光测定法进行追踪。

此处将半胱氨酸插入到通道四个S4区之一的膜外界面位置。通过GFP观察和离子电流记录，证实插入的半胱氨酸以及巯基反应性染料的存在均不影响通道的电压依赖性和电导特性。开启所有荧光测量所需的采集装置组件。

将含有分离肌纤维的35毫米玻璃底培养皿放置在显微镜载物台上。用1,000微升移液器小心吸除培养基，加入2毫升室温的任氏液。使用机械或电动操纵器，将两根铂丝垂直置于培养皿底部。

确保电极触点相对于纤维的纵轴对齐，并距离纤维末端几毫米。如果电极安装在独立的显微操作器上，可通过旋转培养皿或移动每个电极来调整电极位置。打开透射光源，使用20倍物镜在视野中找到纤维。

将EGFP滤光立方体移入光路中。关闭透射光后，使用遥控光快门激活488纳米激发光。为识别EGFP阳性纤维，请将EGFP信号最强的纤维置于视野中央。

在激发光路中使用光阑，将激发光聚焦于纤维的特定区域。这可以在EGFP Cav1.1信号最强的位置进行信号采集。通过机械载物台调节纤维的位置，使其与光阑光路对齐，并记录纤维的XY坐标位置。

返回到第一个保存的定位位置后，将两个连续刺激脉冲的持续时间设置为1毫秒，幅度设置为20伏，脉冲极性设置为交替。然后使用手动触发开关输送这两个连续脉冲。在刺激过程中，观察对两个相反极性脉冲产生的两个同心且均匀的纤维收缩反应。

如果观察到无收缩或仅出现一次向心性收缩伴随交替极性脉冲，则将该肌纤维弃去，不再用于后续实验。直接向培养皿中加入 2 µL 的 10 mM MTS-5-TAMRA 溶液，并用 1,000 µL 移液器轻轻混匀。孵育 4 至 5 分钟，以使荧光巯基分子扩散进入横小管系统管腔。

通过场刺激，施加双极性重复刺激，以每秒50赫兹的频率持续300毫秒，每隔1秒刺激一次，共持续5分钟，以诱发连续的动作电位序列。使用1,000微升移液器从培养皿中移除染色液，并加入2毫升室温任氏液。让染色后的肌纤维至少恢复10分钟，以完成染色方案后的恢复过程。

使用两个交替脉冲重新评估纤维的健康状况和电活动后，将 MTS-5-TAMRA 滤光立方体移入光路，并通过遥控光快门开启 533 纳米激发光，以直观确认纤维上的染色情况。接下来，利用电动载物台上预存的位置，使用 MTS-5-TAMRA 滤光立方体、光圈和 60X 油浸物镜，将纤维置于视野中央。随后，在纤维两端重新调整场刺激铂丝的位置，使铂丝沿纤维主轴呈直线排列，并将它们间距设置为五毫米，纤维位于中央。

在采集软件中，选择将用于数据采集的协议。此步骤仅由计算机控制，并触发所有下游设备，以实现电刺激和光路快门控制。对于每个协议，应尽可能缩短总采集时间，以避免信号漂白；但在首次电刺激之前，需允许数十毫秒的光照和信号采集，以记录基线信号。

点击“执行”以运行方案。记录到的信号将自动显示在屏幕上。由于信号幅度较小，且纤维的机械收缩迅速，信号的大部分常被掩盖，仅显示出运动伪影。

向记录液中加入一微摩尔的100毫摩尔苯甲酰过氧化物甲苯磺酰亚胺，以最小化收缩反应，并进一步区分由纤维激活引起的S4运动所产生的信号。数分钟后，重复运行相同的实验方案。此时运动伪迹已被消除，但仍保留有对应于S4运动的小幅荧光变化。

使用机械载物台轻微移动培养皿，以获取无任何纤维或碎片区域的信号。最后运行一次程序，记录背景荧光，导出轨迹数据，并使用电子表格程序将信号表示为荧光变化量（Delta F）相对于初始荧光值（F zero）随时间的变化曲线，必要时进行基线校正。此处展示了表达EGFP-Kv1.1构建体的已解剖但未离散的肌肉组织的透射光图像和荧光图像示例。

本图展示了表达 EGFP Kv1.1 VSD3 构建体的肌纤维在 MTS-5-TAMRA 染色前后具有代表性的图像。该染料也会对未转染纤维中的内源性半胱氨酸进行染色。EGFP Kv1.1 VSD3 构建体与 MTS-5-TAMRA 染色的共聚焦图像显示出双带模式，这是 Kv1.1 定位于肌纤维横管系统的典型特征。

此处显示的是使用光电二极管记录的、对两个刺激产生的代表性荧光信号响应。两个信号均以其最小值进行归一化处理，并相对于各自去极化时间点绘制为时间函数。这些记录结果表明，对于施加于肌纤维的两种去极化刺激，信号的上升相和达峰时间均相似。