用于测定单细胞材料特性的剪切实验方案

癌症的物理特征是癌症研究中相对较新且令人兴奋的课题。我们的研究旨在具体表征癌细胞与非癌细胞的力学特性，以更深入地理解癌细胞在体内耐受剪切力并侵入免疫系统的物理机制。我所在研究领域的最新进展是微流控装置和高通量技术的应用。

因此，在这项研究中，大规模地研究了细胞的变形能力以及细胞的黏弹性特性，同时也致力于发现新的生物标志物，例如细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白的调控，用于癌症的早期诊断。当前该领域面临的主要实验挑战包括肿瘤微环境的复杂性、研究的规模与通量、临床转化、标准化与可重复性，以及多模态数据的整合。基于我以往和当前的研究，我在该领域取得的一些重要发现是：癌细胞与正常细胞可通过其对机械应力的响应加以区分；而细胞抵抗机械应力的程度依赖于其结构完整性，这种结构完整性在相当程度上由细胞内丝状肌动蛋白等细胞骨架蛋白及其他结构蛋白的存在所决定。

本方案提供了一种简单、可重复且非破坏性的方法，用于在力学层面表征培养细胞。相比之下，原子力显微镜（AFM）和光镊等其他技术则需要较高的操作技术门槛，且通量相对较低。通过应用剪切力检测技术，我们将显著推进单细胞力学特性的表征，并有助于多种跨领域研究，例如罕见病诊断、个体化诊断与治疗，以及单细胞药物相互作用的监测。

开始实验前，需先制备用于剪切力实验的黏性流动培养基。具体操作为：使用磁力搅拌器或加热板将基础培养基在60至70摄氏度下预热约10至20分钟。在持续搅拌培养基的同时，缓慢加入甲基纤维素，以促进甲基纤维素颗粒快速分散，避免结块。

让此过程持续约 15 至 24 小时，以确保培养基与纤维素充分混合均匀。为安装剪切装置，需将橡胶垫圈连接至流路中，以固定流室与培养皿之间的连接，并确保单细胞的流动处于受控且均匀的状态。橡胶垫圈有多种尺寸，可根据所需的流体剖面和观察区域进行选择。

接下来，建立剪切力测定系统，该系统由60或100毫升的双注射器组成，连接至可编程的注射泵，用于黏性培养基的灌注与回抽。将制备好的黏性流动培养基装入一支注射器中，并将其连接至注射泵相应的接口位置，然后将另一支空注射器连接至注射泵的另一个注射器接口位置。

使用一根1/16英寸的管路和管路连接器将两个注射器连接到流室。设置泵以指定流速注入和抽出一定体积的液体，并选择相应的注射器。屏幕上显示了一个程序示例。

从培养皿中吸除细胞培养基，以准备进行剪切。接着将流动室与橡胶垫圈插入并固定在含有贴壁细胞的培养皿上。将装配好的含细胞的微流控流动室置于倒置显微镜载物台上，并连接至显示显示器。

现在，该装置已准备好对单个细胞施加流体剪切应力，并通过光学手段监测细胞的形变情况。要执行单细胞剪切实验方案，请使用预先组装好的剪切装置，该装置包含一个安装好的微流控流动室，放置于含有目标细胞的培养皿上。将整个装置置于倒置显微镜上，并配备足够高倍率的物镜和显示监视器。

调节显微镜物镜，确保具有足够的对比度和清晰的细胞边缘。移动显微镜载物台，使细胞在显示监视器上清晰可见，并呈现为实时图像。在已安装的流动室和培养皿的成像或流动路径内，选择一个细胞或多个独立的细胞。

为保持连续且均匀的黏性介质流动，应选择相近的灌注和抽吸速率。确保流体呈层流状态流动，雷诺数（Re）应小于100。点击剪切泵上的“运行”按钮，以连续速率注入和抽出剪切流体。

确保在液体灌注过程中无气泡产生。在显微镜下，于灌注的剪切液接触目标细胞之前，点击软件上的“Record”开始录制视频。持续录制七分钟，或根据所需应力暴露时间进行录制，直至目标细胞从培养皿底部脱落为止。

当运行按预期完成时，在显微镜软件中点击“停止录制”。软件将自动保存图像和视频，可使用U盘拷贝用于进一步分析。建议以每秒一帧的速率将图像提取为TIFF文件，以便于分析。

使用数字图像相关（DIC）软件进行数字图像相关分析时，将剪切实验记录获得的图像导入DIC软件，建议采用TIFF文件格式。为实现优化的相关性计算，选择“差分和”选项，该选项可追踪新图像相对于上一图像的变形情况。选择子集大小为31 × 31像素，步长为20像素。

确定所选单个细胞的兴趣区域。对于细胞等不规则形状，使用多边形掩膜来勾勒细胞的几何形态。在已勾勒的细胞内选择任意点以追踪形变。

完成映射后，通过点击“添加应变片”并在已定义的细胞边界内选择特定位置（如细胞核或细胞质），绘制单个应变片以进行分析。点击“开始”以启动应变处理，获取应变随时间变化的数据。由此相关性分析生成的应变-时间曲线图可导出为 CSV 文件，以便在 MATLAB 中进行进一步分析。

双击或右键单击生成的应变-时间曲线图，然后选择导出数据。从剪切实验记录中提取的图像帧所获得的数字图像相关（DIC）结果成功生成了与蠕变应力响应兼容的应变-时间数据。采用剪切实验技术的研究结果显示，癌细胞通常比正常细胞更具机械顺应性且黏性更低。

从正常细胞状态到轻度转移状态，再到高度转移状态，随着癌症进展的加剧，细胞的刚度和黏度均呈下降趋势。然而，这些细胞类型的应力松弛时间并未表现出显著差异。