基于DNA张力探针破裂及递送入细胞的高通量流式细胞术细胞机械表型检测

我们的实验室主要研究细胞传递机械刺激所使用的分子机制。近期，我们一直在开发高通量方法，用于测量细胞对其周围环境施加的力，以推动力学生物学进入组学时代。研究表明，机械力参与调控T细胞如何被正确抗原激活，以及干细胞如何分化为特定类型的细胞。

近年来，针对细胞力学异常相关过程的干预已推动了机械治疗药物的发展，为疾病治疗提供了新途径。DNA双链和发夹结构传感器可用于测量细胞外力，而基因编码传感器则能够实现细胞内力学测量。这些方法几乎均需依赖高端显微镜设备。

牵引力显微镜可测量细胞对其周围环境施加的力，但该方法同样需要高分辨率成像。本研究旨在解决该领域的三个挑战：第一，使用流式细胞术而非成像技术进行力学测量；第二，采用 HOH 标签技术将配体和抗体连接至 DNA 探针；第三，使用无需特殊表面处理的标准细胞培养板。细胞产生的力的变化如何可作为疾病状态的预后标志物？这些力是导致疾病状态的原因，还是疾病状态的继发效应？

首先，将带有淬灭基团的锚定链与带有荧光基团的配体链按1.1:1的摩尔比配制双链。配制双链时，溶液中配体链的终浓度为40 µM。为使配制好的双链退火，需在98 °C下孵育5分钟。

然后，将混合物在避光条件下于室温冷却一小时。使用退火步骤中丰度最低的链的浓度（在本例中为配体链）与 HUH 进行反应。将双链与 HUH 按 1:2 的摩尔比混合，双链的终浓度为 10 微摩尔，HUH 的终浓度为 20 微摩尔。

将反应体系置于37摄氏度的热循环仪或避光加热块中孵育30分钟。孵育结束后，从加热设备中取出反应体系，使用台式小型离心机离心收集已组装完成的张力传感器锚定结构（tension gauge tethers, TGTs）。当TGTs充分黏附后，用PBS缓冲液对孔板中的目标细胞洗涤三次。

随后用无血清培养基洗涤两次，最后一次洗涤后将培养基保留在孔中。在周边孔中加入 200 微升 PBS，以减少边缘效应。将培养板转移至 37 摄氏度培养箱中，预热培养板。

然后，在细胞汇合度约为80%时收集目标细胞。吸除培养基，用PBS洗涤细胞，并在37摄氏度下用胰蛋白酶孵育细胞，直至细胞解离，此过程大约需要5至10分钟。细胞解离后，加入先前用于维持细胞培养的完全培养基的原始体积。

使用刻度移液管重悬细胞，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。在300 ×g离心4分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。

重复离心后，将细胞重悬于 5 mL 无血清培养基中，再次离心。吸除上清后，将细胞重悬于约 2 mL 无血清培养基中。测定重悬细胞的密度，以调整至所需浓度。

可选地，如果需要检测药物作用，可向细胞中加入适当浓度的药物，并将细胞放回培养箱中孵育预设时间后再进行后续操作。现在，从培养箱中取出原始培养板，移除实验孔中洗涤后残留的培养基。用所需的培养基将各孔洗涤一次，然后用移液器将100 µL重悬的细胞加入目标孔中。

将接种细胞的培养板转移至培养箱中孵育90分钟。孵育结束后，从每个孔中移除约125至170微升的液体体积。如有需要，用200微升预热的PBS轻柔洗涤细胞。

然后，每孔加入50微升胰蛋白酶，孵育细胞直至细胞开始解离，大约需要5到10分钟。接着，每孔加入160微升 freshly prepared flow buffer。轻轻吹打混匀，使细胞完全解离。

将196微升该细胞悬液转移至PCR管中，加入4微升碘化丙啶，轻轻混匀。最后，将PCR管置于带盖的冰桶中避光，使用流式细胞仪检测荧光强度。通过流式细胞术设门确认成功分离活的单细胞，以确保机械表型分析的准确性。

以Cy5-A荧光信号第99百分位数设定的阴性对照门控，为不同实验条件的比较提供了基线。经Y27632处理的CHO-K1细胞在剪切型TGT上超过阴性对照门控的细胞比例显著降低，而在解旋型TGT上仅表现出轻微且无统计学意义的下降。与剪切型TGT相比，解旋型TGT consistently 导致更高比例的细胞超过阴性对照门控，证实其所需作用力更低。